三、生物素-補(bǔ)骨脂素（Biotin -psoralen)標(biāo)記法
生物素-補(bǔ)骨脂素是另一種生物素光敏物質(zhì)，在長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外線照射下與嘧啶堿基發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，加成到DNA中，去除小分子后，得到生物素標(biāo)記核酸探針。此法可標(biāo)記單鏈或雙鏈DNA或RNA，及寡核苷酸。靈敏度與放射性探針相當(dāng)。標(biāo)記方法：取DNA或片段0.5μg加50μlTE（pH8.0)緩沖液中，再加入5μlg生物素-補(bǔ)骨脂素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射20min，距離5cm，加等體積TE，移入用TE平衡的Sephadex G—50 柱（高1.0cm)，離心法過柱，收集液體即為Bio –DNA探針。
四、生物素-α-氨基乙酸-N-羥基琥珀標(biāo)記化學(xué)修飾的DNA法
此法是在亞硫酸鹽催化下，生物素酰肼可置換寡核苷酸探針中胞嘧啶上的氨基，使生物素結(jié)合到DNA分子上而制成生物素化DNA探針。此法優(yōu)點(diǎn)是采用通用試劑和技術(shù)，檢出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亞硫酸氫鹽存在下可用乙二胺連接臂修飾，此過程也可能介導(dǎo)C-6位的磺酸鹽組分。在合適的條件下，可有3%～4%的堿基被修飾。新鮮配制亞硫酸氫鈉-乙二胺混合液，兩者混合液含量分別為1mol/L和3mol/l （pH6.0)，加入對(duì)苯二酚，使終濃度為1mg/ml。將DNA用超聲打成500～800bp長(zhǎng)度的片段，煮沸法變性，取1份DNA與9份上述混合液混合，42℃水浴3.5h。用5mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH8.5)在40℃下充分透析，濃縮DNA，再溶于200μl 0.1mol/L磷酸鈉緩沖液（pH8.5)，再加入4mmol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羥基琥珀酰亞胺脂，室溫反應(yīng)2h，用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.0)在40℃下充分透析，純化，-20℃保存。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
五、缺口平移法標(biāo)記生物素DNA探針（二步法)
取HBV質(zhì)粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水補(bǔ)足體積至10μl，37℃，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP各2μl，10×NBt 4μl，三蒸水補(bǔ)足體積至10μl,37℃，15min；三蒸水補(bǔ)足體積至49μl，DNA聚合酶i 5u，混勻，14℃過夜，加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl終止反應(yīng)。
已標(biāo)記探針的提純：10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (pH7.5) 150μl,2.5倍體積的95%乙醇，置液氮中15min或-20℃過夜。15000r/min，離心10min，真空干燥后，溶于適量三蒸水中，即為純化的探針，-20℃?zhèn)溆谩?/P>
使用閉環(huán)或線性雙鏈質(zhì)粒DNA，或分離的雙鏈DNA片段均可進(jìn)行此法標(biāo)記，全質(zhì)粒標(biāo)記敏感性較高，因?yàn)闃?biāo)記物可同時(shí)摻入載體DNA。
此法也可用于放射性同位素和地辛標(biāo)記DNA法。
六、生物素隨機(jī)引物標(biāo)記探針方法
以HBV DNA為例。取HBv DNA質(zhì)粒0.5μg，隨機(jī)引物（Pharmacia)2μg，用TE（pH8.0)補(bǔ)足體積至10μl；100℃，熱變性5min，驟冷10min。加10×緩沖液（500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl2, 10mmol/L β巰基乙醇)，BSa 500μg/ml 5μl，5mmol/l dATP/dGTP dCTP各1μl，按不同比例加入Bio –11-Dutp,和dTTP，用三蒸水補(bǔ)足體積至48μl，加DNA聚合酶（SABC)8u，混勻，37℃，2h，加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl，終止反應(yīng)。
在隨機(jī)引物標(biāo)記體系中，加入不同梯度濃度比值的Bio-11-dUTP/dTTP(%)，發(fā)現(xiàn)二者比值明顯影響探針標(biāo)記率和顯色靈敏度。Bio-11-Dutp/dTTP（%)比值為35%時(shí)，其標(biāo)記率最高，顯色靈敏度達(dá)0.2pg，雜交靈敏度為1～2pg。二步法缺口平移標(biāo)記HBv DNA探針，其靈敏度低于隨機(jī)引物標(biāo)記。Mackeg等（Focus,1992；14：21)證實(shí)了用隨機(jī)引物標(biāo)記探針具有放大的效應(yīng)。隨機(jī)引物中加入一定比例的dTTP，能增加HBv DNA探針的標(biāo)記率和靈敏度。其靈敏度接近同位素標(biāo)記探針的靈敏度。
七、異羥基洋地黃毒甙（Digoxigenin)標(biāo)記核酸探針
1988年德國Boehringer Manheims公司推出了一種地高辛標(biāo)記DNA檢測(cè)試劑盒。先將地高辛甙元通過一手臂聯(lián)接至dUTP上，用隨機(jī)引物法標(biāo)記DNA制成探針。平均每20～25個(gè)核苷酸中標(biāo)記一個(gè)地高辛甙元，然后用抗地高辛抗體的Fab片段與堿性磷酸酶的復(fù)合物和NBt – BCIP底物顯色檢測(cè)，靈敏度達(dá)0.1pg DNA，因此可做1μg哺乳動(dòng)物DNA中單拷貝基因分析。此種探針有高度的靈敏性和特異性，安全穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，可避免內(nèi)源性干擾，是一種很有推廣價(jià)值的非放射性標(biāo)記探針。
標(biāo)記方法步驟：（1)取一小離心管（0.5ml)插入冰浴中，加入待標(biāo)記DNa 1μg/5μl，95℃變性10min，迅速移入鹽冰中3min。加入六核苷酸引物2μl，Dig-dNTP標(biāo)記物2μl和消毒雙蒸水10μl、大腸桿菌DNA聚合酶i Klenow片段1μl(單位)。（2)短時(shí)離心，37℃孵育至少60min（20h以內(nèi))。（3)加入2μl 0.2mol/L EDTA溶液中止反應(yīng)。再加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl預(yù)冷的乙醇（-20℃)，放入-70℃至少30min或-20℃過夜。（4)離心（12000g)10min，棄上清，再加入70%乙醇（冷)40μl洗一次，離心，抽干，再溶于50μl TE溶液（pH8.0)中，分裝，-20℃存放備用。
