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（五）高效液相色譜法
高效液相色譜法（HPLC）法的種類(lèi)很多，應(yīng)用也十分廣泛，現(xiàn)將生化藥物中常用的方法概述如下。
1．反相高效液相色譜法（RP－HPLC）以（C4、C8、C18）烷基硅烷鍵合相為柱填料，以甲醇-水、乙腈-水或甲醇、乙腈與緩沖液構(gòu)成的溶液為流動(dòng)相，以紫外、熒光或電化學(xué)檢測(cè)器為檢測(cè)手段，這種色譜體系在生化藥物（例如肽類(lèi)、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等）定量分析中應(yīng)用廣泛。例如：生白能（leucomax）的含量測(cè)定就是采用RP－HPLC法。
本品系基因工程藥物。它的活性成分為重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（γHUGM·CSF），是一種調(diào)節(jié)造血和白細(xì)胞功能所必須的蛋白質(zhì)。含量測(cè)定方法如下。
磷酸緩沖液的配制：稱(chēng)取Na2HPO43.55g，加水400ml，溶解后用稀磷酸調(diào)pH至7.0，加水至500ml，搖勻。
供試品及對(duì)照晶溶液的配制：精密稱(chēng)取供試品或?qū)φ掌愤m量，用上述磷酸鹽緩沖液配制成300μg／ml的溶液即可。
儀器與色譜條件：島津HPLC儀（LC10A）。色譜柱規(guī)格為15cm×4．6mm，柱填料為T(mén)SK ODS120T（5μm）柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：214nmz流動(dòng)相：A液為0．1％三氟乙酸水溶液，B液為乙腈－1％三氟乙酸水溶液（90：10）；梯度洗脫：
（表）
流速：1.0ml／min。在上述條件下依次注入對(duì)照品、樣品溶液各20μl作HPLC分析，其色譜圖見(jiàn)圖。
計(jì)算方法按峰面積外標(biāo)法計(jì)算。本品含量應(yīng)為標(biāo)示量的85.0～110.0％。
本法準(zhǔn)確度高（回收率大于98％），精密度好（RSD小于2％）。tR21.236min的峰為生白能的主成分，tR13.639min的峰為人血白蛋白（生白能的添加劑），主成分與添加劑的分離度R＞2.0。
本法采用梯度洗脫，使主成分與添加劑的分離十分完全。流動(dòng)相中加入三氟乙酸，增大了對(duì)蛋白質(zhì)的洗脫力，且使主成分峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)。
2．高效離子交換色譜法（HPIEC） HPIEC是蛋白質(zhì)、多肽分離分析中常見(jiàn)的方法之一。HPIEC具有以下特點(diǎn)：
1）蛋白質(zhì)、多肽的分離是根據(jù)其相應(yīng)的離子化程度而進(jìn)行的。暴露在外的帶電荷的氨基酸殘端的數(shù)量（如天冬氨酸、賴(lài)氨酸）將影響洗脫過(guò)程。
2）分離過(guò)程是以鹽濃度增大的梯度洗脫法進(jìn)行的。樣品液必須和進(jìn)樣前的流動(dòng)相保持相同的pH和離子強(qiáng)度。為獲得良好的重現(xiàn)性，樣品進(jìn)樣前，柱必須充分平衡。典型的分離梯度是緩沖液為0.3～1.0mol／L的鹽溶液。如有可能應(yīng)盡量避免使用鹵素類(lèi)鹽以延長(zhǎng)不銹鋼柱的壽命。
3）柱效中等并具有較高質(zhì)量的活性回收。雖然獲得的峰比反相色譜更寬，但活性回收更佳�；钚缘鞍踪|(zhì)的回收可通過(guò)不同強(qiáng)弱交換類(lèi)型的選擇而優(yōu)化。對(duì)于一些敏感蛋白質(zhì)，如果回收有問(wèn)題，弱型離子交換劑可獲得更好的活性和質(zhì)量回收。 醫(yī)學(xué).全在.線(xiàn)www.med126.com
（3）高效凝膠過(guò)濾色譜法（HPGFC） HPGFC可用于多肽和蛋白質(zhì)等生化藥物的分離及其分子量的測(cè)定。HPGFC柱上填充著微粒狀的具有親水性表面組成的有機(jī)物載體或表面性質(zhì)得到改造的硅膠類(lèi)物質(zhì)。HPGFC有如下優(yōu)點(diǎn)：
1）活性蛋白質(zhì)可得以回收。填料和樣品間的相互作用在所有的液相色譜技術(shù)中，本法是最溫和的。因此，活性蛋白質(zhì)幾乎可以全部回收，除非流動(dòng)相中含有變性劑，如尿素等。
2）分離是在固定比例的水溶液中進(jìn)行的。流動(dòng)相通常為緩沖液。為了提高分離能力，可加入少量的能與水互溶的有機(jī)改性劑或表面活性劑。
3）分離是根據(jù)蛋白質(zhì)．或多肽在溶液中相應(yīng)的有效粒徑而進(jìn)行的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)具有相同的形狀（如球狀或纖維狀）時(shí)，通�？梢愿鶕�(jù)分子量來(lái)預(yù)示組分的洗脫順序，故可用來(lái)測(cè)定蛋白類(lèi)藥物的分子量。
例如：用HPGFC法測(cè)定重組人腫瘤壞死因子（rh－TNF）衍生物的分子量，現(xiàn)介紹如下。
rh-TNF屬基因工程藥物，其分子量的測(cè)定是該藥質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一。
儀器與色譜條件：島津LC－10A HPLC儀；色譜柱：Beckman Ultraspherogel SEC3000（30cm×7.5mm）柱；流動(dòng)相為0.1mmol／L KH2P04：0.1mmol／L Na2S041：1）＋0.05％疊氮化鈉，流速1ml／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。
標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量曲線(xiàn)的制備選用四種蛋白：醛縮酶、血清白蛋白、碳酸酐酶及抑蛋白酶肽制成混合標(biāo)樣�？紤]到流速等因素對(duì)保留時(shí)間T的影響而選用了內(nèi)標(biāo)法，即在混合標(biāo)樣中加入右旋糖苷藍(lán)和酪氨酸作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣后可同時(shí)測(cè)得完全排阻和完全進(jìn)入填料孔隙的兩種內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間To和Tt，用分配系數(shù)（kd）對(duì)分子量對(duì)數(shù)（lgM.W.）作圖，從而保證測(cè)定結(jié)果有較好的重現(xiàn)性。結(jié)果見(jiàn)表圖
（表圖）
樣品測(cè)定根據(jù)樣品的保留時(shí)間T求出其分配系數(shù)（公式）由從標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量曲線(xiàn)上查出相應(yīng)的lgM.W．，計(jì)算出分子量。測(cè)定了3個(gè)廠家的7批rh－TNF 衍生物樣品，其中3批分子量為45000，提示其天然活性成分形式可能是三聚體；而其他4批分子量為36000，提示其天然活性成分形式可能是二聚體。
（標(biāo)準(zhǔn)蛋白色譜圖）
HPGFC法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，具有快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、簡(jiǎn)便易行、樣品用量少（微克級(jí)）等優(yōu)點(diǎn)，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的重要方法。
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