醫(yī)學(xué)微生物學(xué):第三節(jié)　細(xì)菌的突變

遺傳型變異中常見的一種為突變（Mutation)，即細(xì)菌的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生偶然的改變。一般突變會(huì)導(dǎo)致所編碼蛋白質(zhì)的改變，從而使細(xì)菌出現(xiàn)新的特性或失去原有的某些特性。細(xì)菌的自然突變率與其生物的自然突變相同，每106～108次細(xì)胞分裂發(fā)生一次。由于細(xì)菌每20～30分鐘分裂一代，故突變株相對(duì)較多。當(dāng)突變發(fā)生在DNA一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基引起改變時(shí)，稱為點(diǎn)突變。這類突變涉及堿基對(duì)的置換、增加或缺失。另一種類型的突變涉及大段DNA的改變?nèi)绮迦牖蛉笔�幾百個(gè)堿基對(duì)，稱為染色體畸變。在細(xì)菌中點(diǎn)突變較多見，但在大腸桿菌的染色體中曾發(fā)現(xiàn)有800～1400堿基對(duì)的插入，稱為插入順序(Insertion sequences)。

一、突變與選擇

由于細(xì)菌的突變所發(fā)生的表型變異必須在一定外界環(huán)境下才表現(xiàn)出來，因此對(duì)外界環(huán)境在突變中的作用曾發(fā)生過爭(zhēng)議。曾有學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌與其他生物一樣，需經(jīng)過突變與外界環(huán)境條件選擇而出現(xiàn)突變株；然而也有學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖迅速，外界環(huán)境可直接作用誘導(dǎo)出變異株。這一爭(zhēng)論直到1943年Luria與Delbrgydjdsj.org.cn/sanji/uck進(jìn)行了有名的變異試驗(yàn)(Fluctuation test)后才初步獲得解決。變異試驗(yàn)是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理設(shè)計(jì)的（圖5-1)。將一瓶對(duì)大腸桿菌噬菌體T1敏感的細(xì)菌培養(yǎng)后，稀釋至1，000細(xì)菌/ml,分別分至兩套試管系列。一套僅將細(xì)菌接種至一支大管培養(yǎng)基中，經(jīng)一段時(shí)間培養(yǎng)后，分別接種于數(shù)個(gè)平板。在平板中加入噬菌體，（如果出現(xiàn)耐噬菌體裂解的突變細(xì)菌株則在該平板上應(yīng)出現(xiàn)菌落)以篩選耐噬菌體的突變株菌落。另一套試驗(yàn)為將細(xì)菌分別接種于數(shù)支小試管的培養(yǎng)基，經(jīng)過一段時(shí)間后自每支試管吸取菌液各涂布接種一個(gè)加入噬菌體的平板，然后計(jì)數(shù)發(fā)生的突變耐噬菌體菌株菌落數(shù)。如果出現(xiàn)耐噬菌體菌株是因接觸噬體而誘導(dǎo)產(chǎn)生的，兩套平權(quán)上出現(xiàn)的耐噬菌體菌株菌落數(shù)。如果出耐噬菌體菌株是接觸噬體而誘導(dǎo)產(chǎn)生的，兩套平權(quán)上出現(xiàn)的噬菌體菌落數(shù)應(yīng)大體相等。如果系細(xì)菌自發(fā)突變則兩套平板上的耐噬菌體菌落數(shù)應(yīng)有顯著不同，因?yàn)樵诤笠磺闆r下，細(xì)菌分別在各支試管中各自在生長(zhǎng)繁殖周期或早或遲可發(fā)生突變。突變發(fā)生早的突變株繁殖后出現(xiàn)的子代數(shù)必然多于突變株發(fā)生晚者，因此各平板上的菌落有的很多，有的則缺如。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明兩套平板上耐噬菌體菌落數(shù)差異很大，從萬里證實(shí)細(xì)菌已自身發(fā)生為，而外界是條件僅起選擇作用。

圖5-1 細(xì)gydjdsj.org.cn/shouyi/菌的變異試驗(yàn)

然而，仍有學(xué)者對(duì)上述實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義特異議。1952年Lederberg設(shè)計(jì)了影印培養(yǎng)(Replica plating)（見圖5-2)，這一試驗(yàn)證明細(xì)菌耐藥突變不是由抗菌藥物誘導(dǎo)師產(chǎn)生，而在未接觸抗菌藥物前已產(chǎn)生耐藥突變。其方法為將對(duì)鏈霉素敏感的大腸桿菌大量接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)后細(xì)菌在培養(yǎng)基上均勻的長(zhǎng)出菌苔層，然后用滅菌的絲絨復(fù)蓋在一塊與平皿同樣大小的木塊上輕輕影印，使細(xì)菌菌落全部轉(zhuǎn)移到絲絨面上。另取含有鏈霉素的瓊脂培養(yǎng)平板，將絲絨面再印在其上，從而獲得與原始平板完全相同的復(fù)制平板。將此平板培養(yǎng)，耐藥的菌落出現(xiàn)后，通過比較，可從原始平板的相應(yīng)部位刮取菌苔轉(zhuǎn)種至液體培養(yǎng)基中，增菌后，重復(fù)制備原始平板與影印平板。經(jīng)過數(shù)次重復(fù)后，則可獲得一株完全沒有接觸過鏈霉素的高度耐鏈毒素的突變株，表現(xiàn)為原始平板上全部菌落與含鏈霉素平板上的菌落吻合。這一實(shí)驗(yàn)雄辯地證明了鏈霉素僅起選擇作用。

二、基因突變類型

在明確了細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境條件僅起選擇作用后，學(xué)者們采用了一些選擇方法以獲得突變株，這些突變株的應(yīng)用對(duì)研究遺傳變異及開展有基因工程都很有幫助。大從數(shù)利用的突變型均為大腸桿菌或鼠傷寒沙門氏菌，因這兩種細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，僅需鹽、微量金屬離子及有限的氮、碳來源即可生長(zhǎng)繁殖。未發(fā)生突變的菌株稱為野生型，而發(fā)生突變的菌株則根據(jù)選擇條件可分為：

1．營(yíng)養(yǎng)缺陷型：突變后因某種酶的缺失需要額外添加某種營(yíng)養(yǎng)成份方能生長(zhǎng)繁殖者。一般用“+”代表能利用自然存在的某種成份或能合成某種成份的中間體，而“—代表不能合成該成份的菌株。如his-則代表組氨酸缺陷型，需在培養(yǎng)基中加入組氨酸。

2.抗性突變型:一般以S代表對(duì)化學(xué)藥物或抗生素敏感,r代表有抵抗力。如str8代表該菌株對(duì)鏈霉素敏感，在有鏈霉素存在時(shí)不能生長(zhǎng)。這類突變型最易獲得，應(yīng)用亦廣。

3．發(fā)酵陰性突變型：突變后失去發(fā)酵某種糖的能力但仍能利用其他糖做為碳源。這是由于突變后失去能分解該糖的酶。由于乳糖發(fā)酵可用指示劑根據(jù)pH改變而顯示，故可Lac-（乳糖發(fā)酵陰性)突變株作為研究工具。

圖5－2　細(xì)菌影印培養(yǎng)試驗(yàn)

4．條件致死性突變型：在某一條件下具有致死效應(yīng)，突變株不能生長(zhǎng)，但在另一沒有致死效應(yīng)的條件下仍可生長(zhǎng)。最常用者為溫度敏感性突變型。它們?cè)谟H代能生長(zhǎng)的溫度范圍內(nèi)特別是較高濕度（42℃)不能生長(zhǎng)，但在較低溫度（25℃)則能生長(zhǎng)。這種菌株稱為ts株。其發(fā)生的原因是某些酶的肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后，降低了酶的抗熱性。因此在較高溫度下不能生存。這種用溫度篩選突變株的方法比較簡(jiǎn)便，應(yīng)用較多。

三、基因突變的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

細(xì)菌的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的機(jī)制包括：

1．堿基置換（Substitution)：包括兩種類型：轉(zhuǎn)換(Transition)是由嘌呤置換嘌呤或嘧啶置換嘧啶。顛換(Transversion)是指嘌呤置換嘧啶或嘧啶置換嘌呤。如堿基置換發(fā)生于編碼多肽的區(qū)，則因可影響密碼子而使轉(zhuǎn)錄、翻譯遺傳信息發(fā)生變化，因此可以出現(xiàn)一種氨基酸取代原有的某一種氨基酸。也可能出現(xiàn)了終止密碼而使多肽鏈合成中斷，不能形成原有的蛋白質(zhì)而完全失去某種生物學(xué)活性。

2．堿基的減少、增加與倒置：三種情況都可造成對(duì)密碼的錯(cuò)誤閱讀。如DNA原有堿基順序?yàn)锳AG，GAA，CGC，TGA，如失去第一個(gè)A，則成為AGG，AAC，GCT，GA，使原來編碼押肽由亮一組一丙一蘇氨酸改為半胱-亮-精-亮氨酸。這種突變導(dǎo)致的是密碼意義的錯(cuò)誤，稱為移碼突變。移碼突變的影響范圍自突變點(diǎn)起直到末端整條結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，引起基因產(chǎn)物的變化比較嚴(yán)重，對(duì)生物活性的影響也較顯著。

3．堿基的互變異構(gòu)：四種堿基中的任何一種均可發(fā)生互變異構(gòu)，在作為模板時(shí)可引起互補(bǔ)堿基的改變。如當(dāng)胸腺嘧啶以正常形式（即酮基型)為模板時(shí)，配對(duì)的互補(bǔ)堿基為腺嘌呤；當(dāng)前者變?yōu)橄┐夹徒Y(jié)構(gòu)時(shí)，通過氫鍵配對(duì)的堿基可變?yōu)轼B嘌呤。（圖5-3)

圖5-3 堿基的互變異構(gòu)

細(xì)菌自發(fā)突變的發(fā)生原因可能是宇宙間普遍存在的短波輻射、熱及自然界存在的一些具有致突變作用的物質(zhì)。人工應(yīng)用理化因素可誘發(fā)突變者稱為誘變劑�；瘜W(xué)誘變劑包括核苷酸堿基的類似物如分子結(jié)構(gòu)類似胸腺嘧啶的5-溴尿嘧啶。烷化劑可改變堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)也是誘變劑。吖啶類染料可螯合入DNA的堿基對(duì)之間，引起DNA在復(fù)制過程中出現(xiàn)堿基對(duì)的插入或缺失。紫外線與X線是常用的物理誘變劑。紫外線可使鄰近的胸原嘧啶構(gòu)成雙體，引起DNA結(jié)構(gòu)的變化而致突變。