生物化學(xué)與分子生物學(xué):參考資料

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法

研究蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)從確定組成蛋白質(zhì)的單元結(jié)構(gòu)^��棗氨基酸算起，已有150年的悠久歷史，直到1955年，Sanger首次闡明胰島素的氨基酸排列順序，為研究蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)開(kāi)辟了道路。這在分子生物學(xué)的發(fā)展進(jìn)程中是一個(gè)重要突破。目前關(guān)于核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)研究，由于Sanger等發(fā)明了加減法，可以得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。對(duì)此之下，關(guān)于蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展不如核酸迅速。但隨著Edman液相自動(dòng)順序分析儀和固相順序分析儀以及氣相色譜�操|(zhì)譜(GC�睲S)等方法的相繼出現(xiàn)。使結(jié)構(gòu)分析的速度也顯著加快。至今已完成近千種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。目前不僅樣品用量減少，而且工作人員也大大減少。當(dāng)年Sanger分析胰島素用了整整十年的時(shí)間，今天運(yùn)用自動(dòng)化儀器，分析一個(gè)分子量在10萬(wàn)左右的蛋白質(zhì)只需要幾天，可見(jiàn)新技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展對(duì)科學(xué)發(fā)展起的促進(jìn)作用，蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法的綜述及專著文獻(xiàn)較多，這里只扼要加以概述。

蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，概括起來(lái)包含多肽鏈的分離、降解、肽段的分離和順序分析以及－S－S－定位等。

一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法可概述如下：

1.多肽鏈的分離

在測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以前，首先必須保證被測(cè)蛋白質(zhì)的純度，使結(jié)果準(zhǔn)確可靠。其次要了解它的分子量和亞基數(shù)，按照其亞基數(shù)將蛋白質(zhì)分成幾個(gè)多肽鏈。

1)肽鏈的拆開(kāi)

蛋白質(zhì)分子多肽鏈的連接有共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合兩種。要拆開(kāi)以共價(jià)結(jié)合的-S-S-連接的多肽鏈，必須采用的化學(xué)處理方法常有：

①過(guò)甲酸氧化

用氧化劑過(guò)甲酸斷裂-S-S-。這個(gè)反應(yīng)一般在0℃下進(jìn)行2小時(shí)左右，兩個(gè)S就全部能轉(zhuǎn)變成磺酸基，這樣被氧化的半胱氨酸稱為磺基丙氨酸。

如果蛋白質(zhì)分子中同時(shí)存在半胱胺酸，那么也會(huì)被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，從而增加分析的復(fù)雜性。

②巰基乙醇還原

利用還原劑巰基乙醇亦可使蛋白質(zhì)的-S-S-斷裂。當(dāng)高濃度的巰基乙醇在pH8?條件下室溫保溫幾小時(shí)后，可以使-S-S-定量還原為桽H。與此同時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)中還需要有8摩爾脲或6摩爾鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性，多肽鏈松散成為無(wú)規(guī)則的構(gòu)型，此時(shí)還原劑就可作用于-S-S-。此反應(yīng)是可逆的，因此要使反應(yīng)完全，疏基乙醇的濃度必需在0.1-0.5摩爾。

③Cleland試劑的還原作用

Cleland′s指出二硫赤蘇糖醇(dithioerythriotol)及二硫蘇糖醇(dithiothriotol)在氧化還原能力上是比較強(qiáng)的試劑，只要0.01摩爾就能使蛋白質(zhì)的-S-S-還原，反應(yīng)基本與疏基乙醇相似，且在許多球蛋白反應(yīng)中，可以不用變性劑。

Cleland試劑首先與蛋白質(zhì)-S-S-形成中間物，反應(yīng)終了，還原劑被氧化形成一個(gè)穩(wěn)定的六環(huán)化合物，蛋白質(zhì)則被還原。

還原蛋白不穩(wěn)定，SH基極易氧化重新生成-S-S-鍵。穩(wěn)定SH基的方法有：

(A)烷基化試劑使SH基轉(zhuǎn)變?yōu)榉�(wěn)定的硫醚衍生物。

如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸，其產(chǎn)物S�掺劝奔谆�衍生物不帶電荷，磺代乙酸也可與組氨酸、蛋氨酸和賴氨酸發(fā)生反應(yīng)，但反應(yīng)條件不同，可通過(guò)各種pH及反應(yīng)時(shí)gydjdsj.org.cn/wszg/間進(jìn)行控制。

(B)氨乙基化

蛋白質(zhì)分子的幾條肽鏈若以非共價(jià)健結(jié)合，則用尿素、鹽酸胍等變性劑即可拆開(kāi)。蛋白質(zhì)的多肽鏈被拆開(kāi)后，將它分離純化，一般多用凝膠過(guò)濾、離子交換、電泳等方法，茲不贅述。

分離純化后的每條肽鏈還要進(jìn)一步分析其末端。

2)末端分析　其方法較多，這里我們只介紹較常用的幾種。

(1)N-末端測(cè)定

A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要貢獻(xiàn)之一。

DNP-氨基酸用有機(jī)溶劑抽提后，通過(guò)層析位置可鑒定它是何種氨基酸。Sanger用此方法測(cè)定了胰島素的N�材┒朔謩e為甘氨酸及苯丙氨酸。

B.氰酸鹽法：1963年Stank及Smyth介紹了一種測(cè)定N�材┒说男路椒�，步驟如下：

由于乙內(nèi)酰脲氨基酸不帶電荷，因此可用離子交換層析法將它與游離氨基酸分開(kāi)，分離所得的乙內(nèi)酰脲氨基酸再被鹽酸水解，重新生成游離的氨基酸，鑒別此氨基酸即可了解N-末端是何種氨基酸。

C.二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等報(bào)告了一種測(cè)定N-末端的靈敏方法，采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯，簡(jiǎn)稱丹磺酰氯。它與游離氨基末端作用，方法類似于Sanger的DNFB法，產(chǎn)物是磺酰胺衍生物。

丹磺酰鏈酸具有強(qiáng)烈的黃色熒光。此法優(yōu)點(diǎn)為靈敏性較高(比FDNB法提高100倍，樣品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸穩(wěn)定性較高(對(duì)酸水解穩(wěn)定性較DNP�舶被�酸高)，可用紙電泳或聚酰胺薄膜層析鑒定。

(2)C-末端分析

A.肼解法：這是測(cè)定C-末端最常用的方法。將多肽溶于無(wú)水肼中，100℃下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果羧基末端氨基酸以游離氨基酸狀釋放，而其余肽鏈部分與肼生成氨基酸肼。

這樣羧基末端氨基酸可以采用抽提或離子交換層析的方法將其分出而進(jìn)行分析。如果羧基末端氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)菐в絮０啡?a class="channel_keylink" href="http://gydjdsj.org.cn/pharm/2010/20101030182339_335626.shtml" target="_blank">天冬酰胺和谷氨酰胺，則肼解時(shí)不能產(chǎn)生游離的羧基末端氨基酸。此外肼解時(shí)注意避免任何少量的水解，以免釋出的氨基酸混淆末端分析。

B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據(jù)酶解的專一性不同，可區(qū)分為羧肽酶A、B和C。應(yīng)用羧肽酶測(cè)定末端時(shí)，需要事先進(jìn)行酶的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，以便選擇合適的酶濃度及反應(yīng)時(shí)間，使釋放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

3)氨基酸組成分析

在進(jìn)一步分析多肽鏈的氨基酸順序之前，首先應(yīng)了解它是由那幾種氨基酸組成的，每種氨基酸有多少?分析組成的方法有：

①層析法

將多肽鏈完全酸水解成游離氨基酸，然后進(jìn)行Dansyl標(biāo)記，聚酰胺薄膜層析，此方法在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析中是一種超微量的分析術(shù)，但此方法用于定量分析尚不夠準(zhǔn)確。

②離子交換層析法

Spaekman等發(fā)展了一種精確的氨基酸組分的定量方法。他們采用磺酸型的離子交換樹(shù)脂，這是一種高分子量的固體聚苯乙烯，帶有大量的功能基團(tuán)，磺酸基在低pH和低離子強(qiáng)度條件下，根據(jù)氨基酸的酸堿性，氨基酸帶正電，于是替換下樹(shù)脂上的Na⁺，借助靜電作用而結(jié)合到磺酸基上。

由于各種氨基酸在樹(shù)脂上的親和力不同，因此當(dāng)改變?nèi)芤簆H和離子強(qiáng)度，便可依次將它們洗脫下來(lái)而分開(kāi)，并進(jìn)行定量測(cè)定。在此基礎(chǔ)上發(fā)展了氨基酸自動(dòng)分析儀。隨著科學(xué)技術(shù)的日益進(jìn)展，氨基酸自動(dòng)分析儀在樣品的用量，分離速度及檢測(cè)能力上也有了很大的提高。目前最好的儀器樣品分析量只要幾十Picomole,分析時(shí)間只要數(shù)十分鐘，而且計(jì)算全部自動(dòng)化，給研究蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)帶來(lái)了極大的方便。

2.多肽鏈的降解

多肽鏈的氨基酸組成往往是比較復(fù)雜，因此直接分析多肽的氨基酸順序還是很困難的，多采用將多肽鏈進(jìn)一步降解成為更小的片段，然后再行分析。肽鍵的裂解是一級(jí)結(jié)構(gòu)研究工作中的重要問(wèn)題，它要求裂解點(diǎn)少，選擇性強(qiáng)，而且反應(yīng)產(chǎn)率高，目前主要有化學(xué)法和酶解法兩類。

1)化學(xué)法

(1)溴化氰法　是最理想的化學(xué)方法，能選擇性斷裂甲硫氨酸所在的肽鍵

溴化氫化學(xué)降解法其優(yōu)點(diǎn)：

①一般蛋白質(zhì)含甲硫氨酸較少，由此可獲得大片段

②專一性強(qiáng)

③產(chǎn)率高達(dá)80%以上

④作用條件溫和，在室溫中用幾到十幾小時(shí)即可。

(2)部分酸水解法

Sanger在分析胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)中采用了此法，即用0.1N鹽酸在110℃或用6N鹽酸在37℃水解。這種部分酸水解的方法特異性不強(qiáng)，因此對(duì)大片段的蛋白質(zhì)和肽均不合適。

(3)羥胺法

這種方法近十年來(lái)開(kāi)始受人注意，羥胺能專一性地裂解Asn�睪ly的肽鍵，酸性條件下裂解Asn-Pro肽鍵。已用于某些蛋白質(zhì)的分析。

(4)N-溴代琥珀酰亞胺法

主要裂解Try處的肽鍵，五十年代研究較多。但由于它也能斷裂Tyr�睭is肽鍵，因此應(yīng)用不廣。

2)酶解法

酶水解法較化學(xué)法具有更多的優(yōu)越性，使用也更廣泛。因其具有較高專一性，而且水解產(chǎn)率較高，所以可以選擇各種不同專一性的酶進(jìn)行專一性的斷裂。

常用的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。

胰蛋白酶專一斷裂Lys,Arg的羧基側(cè)肽鍵，如果對(duì)Lys,Arg,CysH進(jìn)行化學(xué)修飾可改變胰蛋白酶的斷裂性質(zhì)。

(1)賴氨酸的修飾。將Lys用順丁烯二酸酐或甲基順丁烯二酸桿修飾，則胰蛋白酶僅使Arg肽鍵斷裂。

順丁烯衍生物在中性pH下穩(wěn)定，胰蛋白酶水解僅使Arg鍵斷裂。在酸性條件下順丁烯衍生物可脫去封閉，此時(shí)再行胰蛋白酶水解，則得賴氨酸為末端的多肽。下述為蛋白質(zhì)中的賴氨酸，經(jīng)順丁烯酰化作用后，被胰蛋白酶水解的例子。

(2)精氨酸的修飾。精氨酸與1，2-和1，3-二羰化合物作用，縮合產(chǎn)物是一雜環(huán)化合物，十分穩(wěn)定。然后胰酶水解僅斷裂賴氨酸殘基末端的肽鍵

(3)半胱氨酸的修飾。若肽鏈內(nèi)Lys、Arggydjdsj.org.cn/pharm/均較少，則為了增加胰酶的裂解點(diǎn)，可以將半胱氨酸進(jìn)行氨乙基化，其產(chǎn)物S�拨陋舶币一�半胱氨酸有類似Lys的結(jié)構(gòu)，胰蛋白酶在水解時(shí)，不能識(shí)別這微細(xì)的變化，從而在半胱氨酸處斷裂。

蛋白水解酶的專一性

肽鏈的裂解和重組大致有三種情況：一種是非特異性裂解，如酸水解。由于裂解的片段較小，造成分離的困難。因此這種非特異性裂解對(duì)大分子肽鏈?zhǔn)遣贿m用的。第二種是特異性裂解，采用兩種以上的專一裂解，然后進(jìn)行組合，這種方法一般也適用于分子量小于5萬(wàn)的蛋白質(zhì)。第三種是逐步的專一裂解，首先將某種氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾，使水解酶專一斷裂某一種氨基酸，分成若干片段，然后解除化學(xué)封閉，再用此酶裂解，使曾被封閉過(guò)的氨基酸斷裂。目前傾向于采用這種裂解方式。

3.肽段的分離

大部分肽段的分離主要通過(guò)凝膠過(guò)濾法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有機(jī)溶劑使之溶解。單用凝膠過(guò)濾法分離之肽一般純度不高，常需輔以離子交換層析法，大片段肽可用離子交換葡聚糖作載體，小肽則多用Dowex-50等樹(shù)脂。

小肽分離還常采用高壓電泳與層析相結(jié)合的指紋圖譜法，得到純凈肽。

4.肽的順序分析

在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定中，肽的順序分析是比較重要的一步。肽的順序分析也有化學(xué)法和酶解法兩種。

1)化學(xué)法�睧dman降解法

這是目前用于順序分析的最主要的方法。它的原理是從N端開(kāi)始，逐步降解。將肽先與異硫氰酸苯酯(PTH試劑)在pH8-9條件下作用，肽的NH₂末端接到異硫氰酸苯酯的C原子上生成苯異硫甲氨酰肽，簡(jiǎn)稱PTC�搽�，在強(qiáng)酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸環(huán)化，肽鍵斷裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一個(gè)失去末端氨基酸的肽鏈。此肽不被破壞，因而又可出現(xiàn)一個(gè)新的N－末端。重復(fù)以上的步驟，繼續(xù)與PTH試劑作用，繼續(xù)分析，苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有機(jī)溶劑抽提出來(lái)進(jìn)行鑒定。但此衍生物很不穩(wěn)定，在水中可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH－氨基酸)。這些步驟通常稱為Edman氏逐步降解法。所以可用來(lái)測(cè)定氨基酸的排列順序。Edman降解法的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量少，靈敏度高。

PTH－氨基酸的鑒定可以用各種層析方法，如紙層析、薄層層析、氣相層析和質(zhì)譜法等，現(xiàn)在多用高壓液相層析法。雖然此方法具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是由于操作繁瑣，工作量大，所以目前有人根據(jù)Edman降解的原理作一系列改進(jìn)。

下面簡(jiǎn)單介紹幾種方法

A.1967年Edman及Begg介紹了一種Edman降解的液相自動(dòng)分析裝置，使順序分析開(kāi)始走向自動(dòng)化。將樣品先在反應(yīng)杯內(nèi)旋轉(zhuǎn)成薄膜，使之固定。然后與PITC試劑反應(yīng)。再用有機(jī)溶劑多次抽提除去過(guò)剩試劑，因而樣品易丟失，且儀器昂貴，使用受到限制。

B.1970年Laursen改進(jìn)為固相氨基酸順序儀。此法樣品用量少，檢出靈敏，可分析20?0肽，其原理是將肽共價(jià)結(jié)合到惰性支持物上，固定后裝柱再行Edman降解。

固相順序儀的惰性支持物有：

此法成功的關(guān)鍵是肽段的固定，目前采用C端α�掺然�固定法，重復(fù)法高，其中以高絲氨酸內(nèi)酯法及雙異硫氰酯法(DITC)最好，固定率可達(dá)90-95%。

C.另外也有從化學(xué)反應(yīng)的角度考慮，試圖改進(jìn)Edman方法。1976年有人將異硫氰酸苯酯的苯基改變?yōu)榧装迸嫉�苯，試劑為甲氨偶氨苯�伯惲蚯杷猁}(簡(jiǎn)稱DABITC)。這是一種有色試劑，產(chǎn)物DABIH�舶被�酸呈桔黃色，因此鑒定時(shí)無(wú)需染色，用肉眼即可分辨。此方法靈敏度很高，一次分析小肽段只要幾個(gè)nanomole樣品即可，是目前一種很可取的方法。此外也有人將異硫氰酸酯進(jìn)行^��35S標(biāo)記，使分析樣品更向微量化方向發(fā)展。

2)酶解法�搽淖V重迭法

分析肽段也可采用酶解法，利用專一性不同的兩種酶將一個(gè)肽分別斷裂成更小的寡肽，比較兩種方法所得之肽段的重復(fù)性，進(jìn)行氨基酸順序的裝配。例如，有一個(gè)肽段，通過(guò)氨基酸組成分析已知其為十肽，假如先以糜蛋白酶水解，則得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。分析結(jié)果如下：

Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val

糜蛋白酶水解

+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)

胰蛋白酶水解

Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val

將此兩套寡肽可以做分析比較，因?yàn)槭�肽的N末端及C末端已事先測(cè)定分別為Ala及Val，因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此類推如下

水解酶也可運(yùn)用二肽酶，兩組可用同一種酶水解如第一套肽是A桞，C桪，E桭，G桯……第二套肽水解則先將該肽段N�捕饲腥ヒ粋�(gè)末位氨基酸，然后再開(kāi)始二肽酶斷裂，結(jié)果是A，B桟，D桬，F(xiàn)桮……這樣分析比較也可排列出肽段順序。

5.二硫鍵定位

蛋白質(zhì)分子不經(jīng)任何處理，直接用酶水解，檢出其中二硫鍵的肽段，然后將二硫鍵拆開(kāi)，分別測(cè)定兩個(gè)肽的順序，將此兩肽結(jié)構(gòu)與測(cè)出的一級(jí)結(jié)構(gòu)比較，就能找出相應(yīng)的二硫鍵的位置。

含二硫鍵肽的檢出方法。

1)凝膠過(guò)濾或離子交換層析：用以分離各肽段，然后用特殊的二硫鍵顯色反應(yīng)找出含二硫鍵的肽。

圖1-21 對(duì)角線電泳技術(shù)圖解

2)對(duì)角線電泳或?qū)游觯?966年Brown及Hartlay提出用對(duì)角線電泳進(jìn)行含－S-S-肽的定位，此方法是將水解后的肽混合物進(jìn)行第一相電泳，樣品點(diǎn)在中間，電泳畢，將樣品紙條剪下，置于裝有過(guò)甲酸的器皿中，用過(guò)甲酸蒸氣處理2小時(shí)，使-S-S-斷裂，此時(shí)含-S-S-肽段的靜電荷發(fā)生了改變。然后將紙條縫于另一張紙上，進(jìn)行第二相電泳電泳，電泳條件與第一相相同，只是與第一次方向成直角。在第二相電泳中，那些不含-S-S-的髣民泳情況與第一相相同，因此電泳后各肽斑均坐落在紙的對(duì)角線上，而那些含-S-S-的肽由于被氧化，電荷發(fā)生變化，第二相電泳速度就與第一相不同，電泳結(jié)果這些肽斑就偏離對(duì)角線，肽斑可用茚三酮顯示。對(duì)角線法由于其速度快，操作簡(jiǎn)便以及能用于小分子樣品，是直接分離-S-S-肽的好方法。

含-S-S-肽被分離后，即可進(jìn)行肽段順序分析，并與已測(cè)定的該蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，即可找出相應(yīng)的-S-S-位置，至此蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)基本闡明。

今后蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定正朝自動(dòng)化、快速化及微量化發(fā)展，關(guān)鍵問(wèn)題仍然是進(jìn)一步尋找蛋白裂解和肽分離的方法。

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定不斷有新方法和新思路出現(xiàn)，如X衍射法測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu)；分離相應(yīng)蛋白質(zhì)的mRNA，由mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)排出蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)等。這些大膽的設(shè)想必將有助于蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定，使人們掌握更多的工具和方法去探索生命的奧秘。