生物化學(xué)與分子生物學(xué):第二節(jié)　基因工程載體

基因工程是要按人們的意愿去有目的地改造，創(chuàng)建生物遺傳性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。分離或改建的基因和核酸序列自身不能繁殖，需要載體攜帶它們到合適的細(xì)胞中復(fù)制和表現(xiàn)功能。對(duì)理想的基因工程載體一般至少有以下幾點(diǎn)要求：

①能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖，而且最好要有較高的自主復(fù)制能力。

②容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且進(jìn)入效率越高越好。

③容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。這就要求載體DNA上要有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。

④容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來，這才便于重組操作。

⑤有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志，當(dāng)其進(jìn)入宿主細(xì)胞、或攜帶著外來的核酸序列進(jìn)入宿主細(xì)胞都能容易被辨認(rèn)和分離出來。這才介于克隆操作。

常用的載體有質(zhì)粒，噬菌體和病毒等。

一、質(zhì)粒載體

質(zhì)粒（plasmid)是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。其特點(diǎn)如下：

①是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA（covalentlyclosed circuar DNA,cccDNA)，可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300kb之間，＜15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取。

②能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子（autonomous replicon)。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)�？呻S宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴(yán)緊控制（stringent control)型質(zhì)粒的復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到十幾個(gè)拷貝；另一類是松弛控制（relaxed control)型質(zhì)粒，其復(fù)制宿主不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。每個(gè)質(zhì)粒DNA上都有復(fù)制的起點(diǎn)，只有ori能被宿主細(xì)胞復(fù)制蛋白質(zhì)識(shí)別的質(zhì)粒才能在該種細(xì)胞中復(fù)制，不同質(zhì)粒復(fù)制控制狀況主要與復(fù)制起點(diǎn)的序列結(jié)構(gòu)相關(guān)。有的質(zhì)粒的可以整合到宿主細(xì)胞染色質(zhì)DNA中，隨宿主DNA復(fù)制，稱為附加體，例如細(xì)菌的性質(zhì)粒就是一種附加體，它可以質(zhì)粒形式存在，也能整合入細(xì)菌的DNA，又能從細(xì)菌染色質(zhì)DNA上切下來。F因子攜帶基因編碼的蛋白質(zhì)能使兩個(gè)細(xì)菌間形成纖毛狀細(xì)管連接的接合（conjugation)，通過這細(xì)管遺傳物質(zhì)可在兩個(gè)細(xì)菌間傳遞。

③質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。這點(diǎn)不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀雙鏈分子，也有獨(dú)立復(fù)制的調(diào)控，但線粒體的功能是細(xì)胞生存所必需的。線粒體是細(xì)胞的一部分，質(zhì)粒也往往有其表型，其表現(xiàn)不是宿主生存所必需的，但也不妨礙宿主的生存。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒，帶有R質(zhì)粒的細(xì)菌就能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖。所以質(zhì)粒對(duì)宿主不是寄生的，而是共生的。醫(yī)學(xué)上遇到許多細(xì)菌的抗藥性，常與R質(zhì)粒在細(xì)菌間的傳播有關(guān)，F(xiàn)質(zhì)粒就能促使這種傳遞。

圖20-2　pBR322及pUC18圖譜

現(xiàn)在分子生物學(xué)使用的質(zhì)粒載體都已不是原來細(xì)菌或細(xì)胞中天然存在的質(zhì)粒，而是經(jīng)過了許多的人工的改造。從不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康某霭l(fā)，人們?cè)O(shè)計(jì)了各種不同的類型的質(zhì)粒載體，近年來發(fā)展很快，新的有特定用途的質(zhì)粒不斷被創(chuàng)建。圖20-2給出最常用的大腸桿菌克隆用質(zhì)粒pUC19的圖譜，此質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)處序列經(jīng)過改造，能高頻率起動(dòng)質(zhì)粒復(fù)制，使一個(gè)細(xì)菌pUC19的拷貝數(shù)可達(dá)500-700個(gè)；質(zhì)粒攜帶一個(gè)抗氨芐青霉素基因，編碼能水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而被壞氨芐青霉素的酶，當(dāng)用pUC19轉(zhuǎn)化細(xì)菌后放入含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，凡不含pUC19者都不能生長，結(jié)果長出的細(xì)菌就是都含有pUC19的；pUC19還攜帶細(xì)菌lac操縱元中的lacI和lacZ基因編碼，β-半乳糖苷酶N端狀146個(gè)氨基酸的段落，當(dāng)培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)物IPTG和Xgal時(shí)，lacz " 基因被誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶N端肽與宿主菌表達(dá)的C端肽互補(bǔ)而具有β-半乳糖苷酶活性（質(zhì)粒和宿主編碼的肽段各自都沒有酶活性，兩都融為一體而具酶活性，稱為α-互補(bǔ)，α-complementation)，半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；在lacz "中間又插入了一段人工設(shè)計(jì)合成的DNA序列，其中密集多個(gè)常用的限制性核酸內(nèi)切酶的位點(diǎn)，使外來的基因和序列能很方便地被插入此位置，當(dāng)外來序列插入后則破壞了lacz "編碼的半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色，這種顏色標(biāo)志的變化就很容易區(qū)分和挑選含有和不含有插入序列或基因的轉(zhuǎn)化菌落，稱為藍(lán)白篩選法。

除常用的大腸桿菌質(zhì)粒載體外，近年來發(fā)展了許多人工構(gòu)建的其它能用于微生物、酵母、植物等的質(zhì)粒載體。含有不止一個(gè)ori、能攜帶插入序列在不同種類宿主細(xì)胞中繁殖的載體稱為穿梭載體（shuttlevectors)。

二、噬菌體載體

噬菌體（phage)是感染細(xì)菌的一類病毒，有的噬菌體基因組較大，加入λ噬菌和T噬菌體等；有的則較小，如M13、f1、fd噬菌體等。用感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體應(yīng)用最為廣泛。

λ噬菌體由頭和尾構(gòu)成，其基因組是長約49kb的線性雙鏈DNA分子，組裝在頭部蛋白質(zhì)外殼內(nèi)部，其序列已被全部測(cè)出。λ噬菌體感染時(shí)，通過尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。DNA進(jìn)入大腸桿菌后以其兩端12bp的互補(bǔ)單鏈粘末端環(huán)化成環(huán)狀雙鏈，可以兩種不同的方式繁殖（圖20-3)：①溶菌性方式（lyticpathway)：在營養(yǎng)充足，條件適合細(xì)菌繁殖時(shí)，利用宿主菌中的酶類和原料，λDNA上基因可按調(diào)控的順序表達(dá)合成構(gòu)成噬菌體頭、尾和尾絲所需的各種蛋白質(zhì)，λDNA經(jīng)多次復(fù)制合成許多子代λDNA，于是裝配成許多子代的λ噬菌體，最后裂菌，釋放出許多新的λ噬菌體。②溶原性方式（lysogenic pathway)：進(jìn)入細(xì)菌的λDNA可整合(integrate)入細(xì)菌的染色質(zhì)DNA中，隨細(xì)菌染色體DNA復(fù)制，傳給細(xì)菌后代，這個(gè)穩(wěn)定潛伏在細(xì)菌染色質(zhì)DNA中的λDwww.med126.comNA稱為原噬菌體(prophage)，含有原噬菌體的細(xì)菌稱為溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的，原噬菌體可從宿主DNA中切出，進(jìn)入溶菌性方式的繁殖。

圖20-3　λ噬菌體的溶菌和溶原繁殖方式

λ噬菌體整個(gè)基因組如圖20-4所示，可分為三個(gè)部分，①左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列。③右臂：長約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對(duì)溶菌生長來說，中段是非必需的。

利用λ噬菌體作載體，主要是將外來目的DNA替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖。現(xiàn)在廣泛使用的λ噬菌體載體也是已作過許多人工改造的，主要的改造是：①設(shè)計(jì)去除λDNA上的一些限制性酶切點(diǎn)。這是因?yàn)棣薉NA較大，序列中的限制性酶切點(diǎn)過多，妨礙其應(yīng)用。②在中段非必需區(qū)，替換插入某些標(biāo)志基因如上述的可供藍(lán)白篩選lacI-lacZ’序列，和多克隆位點(diǎn)等。由此可構(gòu)建出兩類λ噬菌體作載體；一類是插入型載體，可將外來序列插中段，常用的λgt系列載體，一般容許插入5-7kb外來DNA；另一類是轉(zhuǎn)換型載體，即可用外來DNA替代中段，如IMBL系列載體。

圖20-4　野生型λ噬菌體DNA及相應(yīng)的λ噬菌體DNA圖譜

插入或置換中段外來的DNA長度是有一定限制的，當(dāng)噬菌體DNA長度大于野生型λ噬菌體基因組105%或小于78%時(shí)，包裝而成的噬菌體存活力顯著下降。所以λ噬菌體載體可插入長5-20kb的外來DNA，這比質(zhì)粒載體能插入的DNA長得多；而且包裝的λ噬菌體感染大腸桿菌要比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的效率高得多，所以λ噬菌體載體常用于構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫。但λ噬菌體載體的克隆操作要比質(zhì)粒載體復(fù)雜。

如果將左右臂和中段都去除，僅留下λDNA而端包裝噬菌體所必需的cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等，就可構(gòu)成cos質(zhì)�；蚍Q為粘粒的載體。粘粒可插入45kb長的外源DNA，然后用λ噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的DNA能以質(zhì)粒的形式在細(xì)菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫的構(gòu)建。

三、動(dòng)物病毒載體

質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造www.med126.com來自猴腎病毒SV40（Simian Virus 40)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等（見后)。

人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeast artificial chromosome,YAC)載體應(yīng)運(yùn)而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome)、著絲點(diǎn)(centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長度達(dá)200-500kb的外源DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計(jì)劃的重要