實驗動物科學(xué):第五節(jié)　近交系的新進(jìn)展

一、重組近交系

重組近交系（Recombinant　Inbrad　Strain)的發(fā)展和使用，是哺乳類動物遺傳學(xué)中的最重要的發(fā)展。這是近十年發(fā)展起來的，是以兩個無關(guān)的高度近交品系進(jìn)行交配，產(chǎn)生F2代后，再行全同胞交配達(dá)20代以上而育成的一個近交系列組動物。該品系動物既具有其雙親品系的特性，又具有重組后一組內(nèi)和每個重組近交系的特征，因此已廣泛應(yīng)用于新的多態(tài)形基因位點和新的組織兼容性位點的鑒定、多態(tài)形位點的多效性和多態(tài)形位點的連鎖關(guān)系的研究和探測，以及臨界特性的遺傳分析，除此之外，也用于壽命、自發(fā)性和誘發(fā)性疾病感受性的研究，還用于生理學(xué)、藥理學(xué)、形態(tài)學(xué)和行為特性的生物統(tǒng)計分析等方面的研究。

重組近交系名稱的書寫方法是在兩個親本品系名稱之間加一個“X”符號（居中而不留空間)來表達(dá)，品系名稱用縮寫形式。如BALB/cByXC57BL/6By，記為CXB；C57BL/6JXDBA/2J，記為BXD；C57BL/6JXC3H/HeJ,記為BXH；C57BL/6JXSJL/J，記為BXJ。對于其一組內(nèi)的不同品系應(yīng)用阿拉拍數(shù)字加一對開線“-”加以區(qū)別。如BXD-5，BXD-30；BXH-19，BXH-2；BXJ-1，BXI-2等。早年以大寫英文字母來區(qū)分，如由兩個無關(guān)的、近親程度較高的BALB/cBy(縮寫為C)和C57BL/6By(縮寫為B6)品系之間的互交，經(jīng)過20代以上的兄妹交配而育成的，并命名為CXBD、CXBE、CXBG、CXBH、CXBI、CXBJ和CXBK。最近均已不用大寫英文字母而用數(shù)字表示，如AKXC-1，就是AKR和BALB/C品系互交后，經(jīng)兄妹交配而育成的重組近交系之一。已培養(yǎng)成功和正在培育的重組近交系可見表3-3。

表3－3　已培育成功的和正在培育的重組近交系

根據(jù)1981年Bailey的統(tǒng)計資料看，目前至少有28個重組的近交系列組，見表3-4。

表3－4　RI品系的來源與建立（Bailey,1981)

二、同源導(dǎo)入近交系

將一個基因?qū)�入到一個近交系（通過多次回交)而培育成的新的近交系稱為同源導(dǎo)入近交系（Congenic　Inbred　Strain)，也稱為“近交同類系”或“同源抵抗系”，簡稱IR系。這是Snell(1948年)的大發(fā)明，通過人工培育成功了IR系。例如，他用易感受與好發(fā)某腫瘤的近交系小鼠，導(dǎo)入另一品系對該腫瘤無易感性的基因（不同的組織兼容性基因)，先雜交一次導(dǎo)入，爾后通過一系列的子代互交、測驗以及回交的辦法而育成IR。具體方法參看圖3-4。圖中的A系為易感受與好發(fā)某種腫瘤，在A系內(nèi)移植A系腫瘤都能增殖生長，因為它們是同質(zhì)動物，不起排異反應(yīng)。如果將A系腫瘤移植到B系動物，腫瘤就不能生長，因為B系與A系之間的組織www.gydjdsj.org.cn/job/相容性基因不一樣，所以B對A的腫瘤起排異反應(yīng)。從A品系的角度培育對A系腫瘤無易感性的IR品系的方法是，讓基代A與B交配，生下子1代，再讓子1代互交得2代。此時將A系腫瘤移植給子2代，選腫瘤不長的小鼠留種與A品系回交得子3代，再讓子3代互交得子4代，此時再移植A系腫瘤給子4代。如此反復(fù)，一直進(jìn)行到第12～14代，選不長腫瘤的小鼠以全同胞兄妹交配形式建立了A·B品系。此A·B系即為A系的IR系，兩者也就是互為同類系。新培育的A·B系除組織相容性基因與A系同外，其它基因則基本相同，這樣配對的品系可開展許多科研，且得到了重大的成果。按這個模式，可以培育出各種各樣的同類系。

圖3-4　Snell培育IR系小鼠的方法

三、異單基因近交系

相同近交品系的動物內(nèi)，如果發(fā)生了單個基因的突變，而培育成的新的近交品系稱異單基因近交系（Colsognic　Inbred　Strain)。譬如近交系小鼠129的種群中，某些個體發(fā)生了“肌萎縮癥”的隱性遺傳突變，由dy基因控制這個性狀。這個突變育成了dy的突變品系，稱為129-dy。這樣129與129-dy便互交成為了同類系，因為它們兩系除dy一對等位基因之外，其他基因都基本是一致的。這一對同類系是天然發(fā)生而通過人工選擇育種的成功的，用這一對同類系來對肌萎縮癥進(jìn)行對比研究有重大價值。其他諸如在貧血方面的研究等等，也有許多類的例子。

同源導(dǎo)入近交系和異單基因近系通稱為同類系，并稱同源株（Congenic　stock)，是在一個近交品系內(nèi)發(fā)生了一個重要的單個基因突變，或者通過一系列的多次雜交和回交把一個基因?qū)�入一個近交背景品系內(nèi)部形成與原株相對應(yīng)的同源株。

其命名是在原來品系或亞系名稱符號之后加一連接號“-”，再寫一斜體字的基因符號。如果這個基因是隱性的則字母全用小寫，如果是顯性的則第一個字母用大寫，如DBA/Ha-D,129-dy等。

如果突變基因或?qū)�入基因仍處于雜合狀態(tài)，則在“-”后添一加號“+”，再加基因符號，如A/Fa—+C，C3H/N-+Wj。

當(dāng)同類系是采取中制雜合近親繁殖的，則其分離位點是否寫出隨意，例如129或129-CcbC；SEAC-a+/+se或SEAC/Gn。

通過反復(fù)雜交將顯性基因?qū)�入一個近交品系里，至少回交7代才能建立同類系，因此要在括號內(nèi)標(biāo)明回交代數(shù)，如C57BL/6-Wv+(N8)。（Wv是“活顯性白斑”基因，是W的等位基因)。至于代數(shù)計數(shù)，是把第一次雜交（bybrid)的F1計算為第一代，第一次回交所產(chǎn)生的下代計算為第二代，以此類推。

同源株如在兩個品系雜交中形成，其命名符號，一般是由最初雜交的兩個品系的命名符號所形成，例如，B1O，D2/OSnN（特征是缺少補(bǔ)體5)，O代表Old（老)，BIO·D2/OsnN（特征是有補(bǔ)體5和腦積水者較常見)，n代表new(新)。

我國現(xiàn)已引進(jìn)的突變同類系（異單基因近交系)有：C57BL/6J-Ob/Ob，為先天性肥胖型動物模型，血糖偏高。C57BL/KS-db/db，為Ⅰ型糖尿病模型。C57BL/6J-bg/bg，為NK細(xì)胞缺陷的模型。

四、遺傳工程與近交系的發(fā)展

遺傳工程是70年代興起的一門嶄新的科學(xué)技術(shù)，它使人類進(jìn)入了定向控制生物遺傳性狀的新階段。

所謂遺傳工程也就是根據(jù)人們的意愿，采用工程建筑的手法，按照預(yù)先設(shè)計的方案，借助于實驗室手段將一個生物體的遺傳物質(zhì)定向地轉(zhuǎn)移到另一個生物體中去，使后者獲得人類希望的性狀，成為一個新的“物種”。這們就打破了傳統(tǒng)的、必須經(jīng)過兩性雜交的育種方法，使原來在自然狀態(tài)下根本不可能發(fā)生有性繁殖的兩種生物的基因結(jié)合在一起了。

遺傳工程的概念可分為廣義的和狹義的兩種。廣義的遺傳工程包括細(xì)胞工程、染色體工程和基因工程三類，使用的是細(xì)胞生物學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，包括細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體導(dǎo)入和基因或DNA分子的轉(zhuǎn)移等。廣義的遺傳工程又稱為微生物工程或細(xì)胞工程。狹義的遺體工程僅限于基因工程。

早期的遺傳工程的研究工作大多數(shù)是在病毒、噬菌體和細(xì)菌中進(jìn)行的。因為這些生物的遺傳物質(zhì)比較簡單，容易搞清楚遺傳物質(zhì)與生物性狀之間的關(guān)系。隨著知識的積累，技術(shù)的提高，現(xiàn)在越來越多的遺傳工程實驗開始在高等哺乳類動物身上進(jìn)行了。這尤其促進(jìn)了近交系小鼠的發(fā)展。

（一)細(xì)胞工程與近交系小鼠的發(fā)展

1．嵌合體小鼠（Mouse　Aggregation　Chimeras)的育成。嵌合體小鼠技術(shù)是由Tarkowski和Mintz分別在華沙和費城發(fā)展的（見圖3-5)。他們首先用兩對不同品系的近交系小鼠在同一時刻進(jìn)行純交，為了使其后代便于區(qū)分，常選擇毛色不同品種的近交系小鼠例如選用白毛的SJL小鼠與黑毛色的BL/10小鼠。當(dāng)受精卵分裂為8分裂球時，分別將它們從各自母體的子宮上分離下來。然后用蛋白酶消化分裂球外面的明帶，使分裂球“裸露”。并在37℃的條件下，將來自兩個品種的兩個分裂球彼此接觸，任其粘成一個具有雙倍體積的早期胚胎。將早期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)到具有128～256個細(xì)胞的胚囊。這時，不同毛色品系的細(xì)胞相互混雜發(fā)育在一起。然后，通過手術(shù)把胚囊移植到寄養(yǎng)母鼠的子宮內(nèi)，讓它繼續(xù)發(fā)育，直至出生。新生小鼠長出毛后，其毛色表現(xiàn)為既不象父親SJL品系的全白色，也不象母系BL/10品系的全黑色，而是表現(xiàn)出黑、白條或塊狀的毛色。這說明新生鼠的組織是由“黑色”細(xì)胞和“白色”細(xì)胞嵌合而成的，是一只嵌合體小鼠。

圖3-5　嵌合小鼠育成

近交同類系動物也是近交系動物，它除了一小段帶有可辯的目的基因染色體外，在遺傳上與原來已建立起來的那個近交系完全一致。近交同類系動物的培育，是選用帶有目的基因的個體與已經(jīng)建立起來的近交系雜交建立起的。應(yīng)用近交同類系動物可以研究多基因系統(tǒng)中一個基因的特殊作用，施耐爾博士（Snell)是第一個應(yīng)用這種體系進(jìn)行組織移植基因研究的，建立了同類抵抗系學(xué)說，為小鼠的主要組織相容性抗原的研究做出了巨大貢獻(xiàn)，為此獲得了1981年的諾貝爾獎金。

同類系動物的命名基于如下兩種方式。一種是帶有近交品系和供體品系的復(fù)合符號，中間帶有一點，例：B6·AKR。第二種命名法是近交品系后面加上一橫，然后標(biāo)上供體品系特異的基因位點的符號。這樣B6·AKR也可以寫作B6-H-2k。對于最近培育的同類系，小鼠遺傳標(biāo)準(zhǔn)命名委員會建議同時采用兩種方式，這樣B6·AR或B6-H-2k應(yīng)該寫為B6·AKR-H-2k。

如果進(jìn)一步研究嵌合體小鼠的其它性狀，還可以發(fā)現(xiàn)嵌合體小鼠將雙親的各種不同的性狀都嵌合起來了。例如Mintz(1967，1971)證明用DBA/2和C3H兩種不同品種的近交系所嵌合的后代具有不同的異檸檬酸脫氫酶（IDH-1)或蘋果酸脫氫酶（MDH)，利用電泳技術(shù)可以將它們彼此分開。除了雙親具有的酶以外，嵌合體內(nèi)有時還可以發(fā)現(xiàn)第三種酶，即雙親的“雜種”或異多聚酶。以上的工作對于細(xì)胞水平的遺傳性研究是具有重要意義的，受到人們越來越多的重視。

嵌合體小鼠近年來已應(yīng)用于細(xì)胞和組織的動力學(xué)研究，如研究小腸上皮細(xì)胞移行規(guī)律及其定位等。

2．單親純合雙倍體動物的育成。單親純合雙倍動物育成技術(shù)又稱為雌核發(fā)育技術(shù)。這是一種相當(dāng)于植物中由花粉培育成純合雙倍體植株的技術(shù)，其結(jié)果都是培育出具有兩套完全一致的染色體及基因的個體。

眾所周知，不論在生產(chǎn)上還是在科學(xué)試驗中都需要純系動物。為了得到一個純系動物，一般要花費數(shù)年時間，甚至一生的光陰。既使對世代周期較短的小鼠，采用了最有效的兄妹交配方法，還需要連續(xù)兄妹交配20代以上才能獲得純系動物，這也要幾年時間。如果采用單親純合雙倍體育成的技術(shù)來育成一個純系動物，則將大大地縮短育種周期，小鼠只需三周，牛也只需幾個月。具體方法見圖3-6。

圖3-6　單親雙位體動物育成（雌核發(fā)育)

首先將兩個不同品系的的近交系進(jìn)行雜交（例如SJLXBL/10)，交配后，在精核與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內(nèi)沖取受精卵并用極細(xì)的吸管將雄核去掉。然后在細(xì)胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細(xì)胞，二倍體細(xì)胞在體外繼續(xù)培養(yǎng)到胚囊期后，移植到養(yǎng)母的子宮內(nèi)使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。一般選擇毛色與雙親不同的品系作為養(yǎng)母，以易于區(qū)分。本例中是選擇毛色為野生色的BL/10XSJL雜交鼠作為養(yǎng)母的。養(yǎng)母本身沒有經(jīng)過交配，因而出生的小鼠均為移植進(jìn)去的胚胎發(fā)育而成，它表現(xiàn)出親母鼠純合的性狀。若出生的新生鼠表現(xiàn)為野生色，則說明實驗技術(shù)失敗，并未剔除精核。

單親純合雙倍體技術(shù)也已在魚類和家兔中獲得成功。

3．細(xì)胞核移植系的產(chǎn)生。在單親純合雙倍體育成技術(shù)中已提到了核移植技術(shù)，但這僅是該技術(shù)的初步。若能將受精卵中的精核，與卵核都移出，然后再將來自其它細(xì)胞新核移入受精卵，并能順利地完成新胚胎的正常發(fā)育，核移植技術(shù)就算成功了。以前，完整的核移植技術(shù)僅在兩棲類和昆蟲中取得成功。1981年日內(nèi)瓦大學(xué)的伊爾曼斯（K.Illmensee)和美國杰克遜研究所的霍普（P.C.Hoppe)首次在小鼠中完成了核移植技術(shù)，開創(chuàng)了哺乳動物核移植成功的先例。具體方法見圖3-7。

圖3-7細(xì)胞移植系的產(chǎn)生

（1)將內(nèi)細(xì)胞塊細(xì)胞里的核用吸管吸出。

（2)將取出的核輸?shù)搅硪粋�精核與卵核尚未融合的受精卵內(nèi)。

（3)吸出該受精卵本身的精核與卵核。

（4)受精卵在體外發(fā)育到胚胎細(xì)胞。

（5)將胚盤細(xì)胞移植到白色的養(yǎng)母小鼠的子宮內(nèi)。

（6)出生的小鼠長出灰毛，說明細(xì)胞移植系實驗成功。

（1)首先用灰色的小鼠品系進(jìn)行雌雄交配（也可用其它毛色的品系)，從母體的子宮內(nèi)獲得胚盤細(xì)胞。胚盤細(xì)胞包括營養(yǎng)外胚葉細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞塊細(xì)胞兩種，后者將來可形成胚胎。若錯誤地取了營養(yǎng)外胚葉細(xì)胞就要導(dǎo)致實驗失敗。

（2)用極細(xì)的吸管取出內(nèi)細(xì)胞塊細(xì)胞的細(xì)胞核，并將它注到剛受精的、但卵核與精核尚未融合的黑色小鼠的受精卵內(nèi)。

（3)從黑色小鼠的受精卵內(nèi)取出吸管時，將黑色鼠受精卵原有的卵核和精核吸出。

（4)將處理過的受精卵在體外培養(yǎng)到胚盤細(xì)胞期，再將它移植到白色的養(yǎng)母小鼠的子宮內(nèi)，讓它繼續(xù)發(fā)育。

（5)產(chǎn)出的新生小鼠必須會長出灰色的毛，這就是細(xì)胞核移植鼠。

由于主要的遺傳物質(zhì)存在于細(xì)胞核中，所在核移植的受體將具有與核移植供體完全相同的遺傳基礎(chǔ)。因此，細(xì)胞核移植系技術(shù)在動物育種工作中具有十分重要的意義。因為它象植物中的組織培養(yǎng)那樣，可以利用一頭優(yōu)質(zhì)的動物（例如高產(chǎn)的奶牛)復(fù)制出與它生得完全一樣的成千上萬的細(xì)胞核移植系動物。

（二)實驗小鼠染色體工程進(jìn)展

所謂染色體工程是以染色體為單位進(jìn)行有意識的切割、修補(bǔ)或成條、成套地增加，將人類需要的遺傳性狀集中在一起，創(chuàng)造出新的物種。以往的染色體工程一般均采用物理的或化學(xué)的方法。在高等動物中，由于多倍體或者染色體嚴(yán)重缺失與重復(fù)的個體都不容易成活，所以高等哺乳動物的染色體工程目前均是在細(xì)胞水平上采用細(xì)胞融合技術(shù)進(jìn)行。

Harris和Watkins(1965)首先制備了包含小鼠和人類細(xì)胞的種間異核本。他們將由宮頸癌組織培養(yǎng)出來的人類HaLa細(xì)胞和小鼠細(xì)胞（生長在腹膜腔中Ehrlich小鼠腫瘤細(xì)胞)置于同一培養(yǎng)液中，加入經(jīng)紫外線滅活了的仙臺病毒（Sendai　Virus，是粘病毒的副流感群中的一種)。在仙臺病毒的作用下使兩種細(xì)胞發(fā)生融合。融合細(xì)胞開始有兩個來自不同物種的細(xì)胞核，稱為異核體，這一點可以通過同位素標(biāo)記的方法加以證實，事先他們用氚標(biāo)記的胸苷來標(biāo)記HaLa細(xì)胞的細(xì)胞核，而在一個異核體細(xì)胞內(nèi)，可以發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的和不標(biāo)記的兩個細(xì)胞核。異核體的兩個核融合后就可以繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞分裂，并形成單核細(xì)胞系。雜種細(xì)胞大，容易認(rèn)別。它在以后的不斷的分裂過程，人類的一套染色體和小鼠的一套染色體并不是都隨著細(xì)胞的分裂進(jìn)行復(fù)制的。在正常的條件下，人類的染色體將隨著細(xì)胞的分裂而逐漸丟失。這種丟失是隨機(jī)的。所以最后形成的雜種細(xì)胞往往都是帶有一整套小鼠染色體加上不同數(shù)目和不同編號的人類染色體（或帶有絲粘的片斷)，由于現(xiàn)代染色技術(shù)發(fā)展，使人們不僅可根據(jù)染色的結(jié)果很容易地區(qū)分人類染色體與小鼠染色體，而且可以確定在雜種細(xì)胞中留下來的是哪一條或者哪幾條人類染色體。

如果使用的小鼠細(xì)胞是營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，即細(xì)胞本身不能合成某種必需營養(yǎng)物，只有在培養(yǎng)液中添加了這種營養(yǎng)物質(zhì)后細(xì)胞才能正常地生長。小鼠營養(yǎng)缺陷型根據(jù)其所需的不同種營養(yǎng)物有許多不同的種類。如果將某種小鼠營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞與人類正常細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞。這時小鼠的營養(yǎng)缺陷可由于人類染色體上的有關(guān)基因的存在，該種生存必需營養(yǎng)物得到彌補(bǔ)，雜種細(xì)胞在不添加該營養(yǎng)液中的也能正常生長。經(jīng)過一段時期培養(yǎng)，保留下來的細(xì)胞除帶有一整套小鼠染色體外，至少還穩(wěn)定地保留了一條與該營養(yǎng)物合成有關(guān)的人類染色體。如果我們使用多種營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為遺傳標(biāo)志，就可有得到許多不同的雜種細(xì)胞，通過分析比較，就可能確定在人類的遺傳中那種營養(yǎng)物質(zhì)合成的基因在哪一條染色體。我們不僅可以用營養(yǎng)缺陷基因作為標(biāo)志，還可以采用生化、免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)有關(guān)的基因作為標(biāo)志基因，這樣就可以把決定嘌呤酶的基因，決定各種碳水化合物、氨基酸以及脂肪代謝的基因，氨基酰-tRNA合成的基因，遺傳性疾病的基因（例如白內(nèi)障、指甲髕骨發(fā)育不全)，對白喉和脊髓灰質(zhì)炎等毒素易感性基因，細(xì)胞表面抗原基因和多肽酶基因等作為標(biāo)志基因，結(jié)果就可以完成對更多的基因染色體定位工作�，F(xiàn)在已定位在人類染色體的基因數(shù)目已超過了210個，對人類遺傳學(xué)的研究作出了很大的貢獻(xiàn)。

（三)實驗小鼠基因工程進(jìn)展

超級小鼠的產(chǎn)生。1982年末Palmiter和Brister報導(dǎo)，他們把小鼠MT-1基因的啟動子與大鼠生長激素（GH)基因結(jié)合，制成融合基因（MGH)，然后將MGH插入到大腸桿菌的質(zhì)粒中，擴(kuò)增，備用；把收獲的MGH基因注入小鼠受精卵的雄性前核；然后將這些受精卵移植到養(yǎng)母小鼠的子宮內(nèi)，直至分娩。

結(jié)果在出生的21只小鼠中有7只帶有MGH基因，6只小鼠的每個細(xì)胞均有兩個以上的MGH（多的可達(dá)35個)。在攜帶MGH的小鼠肝細(xì)胞中檢出的MGH-mRNA數(shù)目高達(dá)3000個血液中生長激素濃度明顯增高，表明MGH基因已得到表達(dá)。含有兩個以上MGH基因的6只小鼠，生長迅速，個別的為正常小鼠的兩倍，成為所謂的“超級小鼠”。含有MGH基因的小鼠與普遍小鼠雜交的結(jié)果，子代19只小鼠中有10只含有MGH基因。MGH基因可以從親代向子代遞這一事實說明MGH基因已整合到小鼠染色體上去了。

最近也有人報導(dǎo)了利用人類的生長激素基因使小鼠成為超級小鼠的。超級小鼠的育成，開創(chuàng)了基因工程在哺乳類動物中獲得成功的首例。它對于醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)的發(fā)展有著極其深遠(yuǎn)的意義和廣闊的前景。