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實(shí)驗(yàn)動物科學(xué):第五節(jié) 影響動物實(shí)驗(yàn)效果的動物實(shí)驗(yàn)技術(shù)環(huán)節(jié)因素

一、動物選擇選擇好適合研究需要的實(shí)驗(yàn)動物是獲得正確實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)成功的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)按照不同實(shí)驗(yàn)的要求選擇合適的動物。如作腫瘤的研究工作,就必須了解哪種動物是高癌種,哪種是低癌種,各種動物自發(fā)性腫瘤的發(fā)生率是多少。如A系、C3H系、AKR系、津白Ⅱ等小鼠是高癌…

一、動物選擇

選擇好適合研究需要的實(shí)驗(yàn)動物是獲得正確實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)成功的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)按照不同實(shí)驗(yàn)的要求選擇合適的動物。如作腫瘤的研究工作,就必須了解哪種動物是高癌種,哪種是低癌種,各種動物自發(fā)性腫瘤的發(fā)生率是多少。如A系、C3H系、AKR系、津白Ⅱ等小鼠是高癌品系小鼠,C3H/He系經(jīng)產(chǎn)雌鼠有80~100%的自發(fā)性乳腺癌。AKR系8~9月齡小鼠有80~90%自發(fā)性血病。C57BL系、津白Ⅰ等小鼠是低癌品系小鼠。不同動物對同一因素的反應(yīng)雖然往往是相似的,但也常常會遇到動物出現(xiàn)特殊反應(yīng)的情況。如5歲以上的雌狗常自發(fā)性乳腺腫瘤,如果給雌狗孕激素,就更容易誘發(fā)乳腺腫瘤。雌激素還容易引起狗發(fā)生貧血,這在其它實(shí)驗(yàn)動物是很少見的。怎樣選擇好實(shí)驗(yàn)動物可參看實(shí)驗(yàn)動物的選擇和應(yīng)用一講。

二、實(shí)驗(yàn)季節(jié)

生物體的許多功能隨著季節(jié)產(chǎn)生規(guī)律性的變動。目前已有大量資料表明,動物對化學(xué)物作用的反應(yīng)也受到季節(jié)的影響。例如在春、夏、秋、冬分別給10只大鼠注入一定量的巴比妥納,發(fā)現(xiàn)入睡時間以春季最短。秋季最長,而睡眠時間則相反,春季最長,秋季最短(見表11-19)。

表11-19 大鼠對巴比妥納反應(yīng)的季節(jié)變動

季 節(jié)入睡時間(分)睡眠時間(分)
56.1±11.0470±34.0
93.5±11.3242±14.3
120.0±19.0190±18.7
66.5±8.2360±33.0

不同實(shí)驗(yàn)季節(jié),動物的機(jī)體反應(yīng)性有一定改變。如不同季節(jié)對輻射效應(yīng)有影響。家的放射敏感性在春夏兩季升高,秋冬兩季降低。在狗的實(shí)驗(yàn)中,在春、夏兩季照射后的死亡率比秋、冬為高。小鼠的放射敏感性,在冬季和補(bǔ)夏顯著升高,而初夏和夏季則降低。大鼠的放射敏感性則沒有明顯的季節(jié)性波動。因此,這種季節(jié)的波動在進(jìn)行跨季度的慢性實(shí)驗(yàn)時必須注意的。

三、晝夜過程

機(jī)體的有些功能還有晝夜規(guī)律性變動。例如有人給小鼠皮下重復(fù)注入40%的四氯化碳溶液0.2ml后,在同一天不同的時間將動物處死,觀察肝細(xì)胞的有絲分裂動態(tài),以了解肝細(xì)胞變性的修復(fù)情況。結(jié)果列于表11-20。資料表明,小鼠肝細(xì)胞有絲裂的晝夜變動十分明顯。

表11-20 小鼠肝細(xì)胞有絲分裂系數(shù)(‰)的晝夜變動

分組晝 夜 的 鐘 點(diǎn)
024678910
實(shí)驗(yàn)組2.4±1.22.6±1.21.02±0.174.11±0.270.26±0.061.36±0.250.66±0.250.57±0.08
對照組2.8±1.862.6±0.160.2±06.3±1.480.46±0.070.26±0.070.97±0.050.66±0.04

動物對照射的敏感性在晝夜間有不同的變化,這種變化見于不同性別、種系和年齡的小鼠和大鼠。白天放射敏感性降低(死亡較少,LD50/30較高,體重下降較少,肝臟損傷較輕)夜間升高。同時,在小鼠和大鼠實(shí)驗(yàn)中,除了夜間(21~24點(diǎn))的高峰外,還發(fā)現(xiàn)白天(小鼠9~12點(diǎn),大鼠15點(diǎn))損傷加重情況。下午和后半夜射敏感性最低。大鼠與小鼠不同,其放射敏感性雖有晝夜間的明顯波動,但不很劇烈。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)動物的體溫、血糖、基礎(chǔ)代謝率、內(nèi)分泌激素的分泌均發(fā)生晝夜節(jié)律性變化。因此這類實(shí)驗(yàn)的觀察必須設(shè)有相應(yīng)的對照,并注意實(shí)驗(yàn)中某種處理的時間順序結(jié)果的影響。為了得到可比性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,所有實(shí)驗(yàn)組動物應(yīng)在同一時間內(nèi)進(jìn)行照射或其它實(shí)驗(yàn)處理。

四、麻醉濃度

動物實(shí)驗(yàn)中往往需要將動物麻醉后才能進(jìn)行各種手術(shù)和實(shí)驗(yàn)。要求麻醉濃度要適度,而且在整個實(shí)驗(yàn)過程中要保持始終恒定。因此不能不分別實(shí)驗(yàn)要求和動物品種(或品系)而用同一種麻醉劑,也不能亂用麻醉劑。因?yàn)椴煌穆樽韯┯胁煌乃幚碜饔煤透弊饔茫瑧?yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求與動物種類而加以選擇,使用合適。麻醉濃度的控制是順利完成實(shí)驗(yàn)獲得正確實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保證。如果麻醉過深,動物處于濃度抑制,甚至瀕死狀態(tài),動物各種正常反應(yīng)受到抑制,那是不會做出可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的。麻醉過淺,在動物身上進(jìn)行手術(shù)或?qū)嶒?yàn),將會引起強(qiáng)烈的疼痛刺激,使動物全身,特別是呼吸,循環(huán)功能發(fā)生改變,消化功能也會發(fā)生改變,如疼痛刺激會反射性的長時間中止胰腺的分泌。所以麻醉濃度必須合適。由此也不難理解在整個實(shí)驗(yàn)中保持麻醉濃度的始終一致是如何必要了,因?yàn)槁樽頋舛鹊淖儎,會使?shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生前后不一致的變化,給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來了難以分析的誤差。

五、手術(shù)技巧

動物實(shí)驗(yàn)中除了要注意選擇合適的實(shí)驗(yàn)動物,用的試劑要純粹,儀器要靈敏,方法要準(zhǔn)確外,還必須注意手術(shù)技巧,即操作技術(shù)的熟練。手術(shù)熟練可以減少對動物的刺激,動物受的創(chuàng)傷、出血等就少,將會提高實(shí)驗(yàn)成功率和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。要達(dá)到動物手術(shù)操作熟練,必須要了解各種動物的特征,組織、器官的位置,神經(jīng)、血管的走行特點(diǎn),通過在動物身上反復(fù)實(shí)踐,即可達(dá)到熟中生巧、操作自如。

六、實(shí)驗(yàn)藥物

動物實(shí)驗(yàn)中常常需要給動物體內(nèi)注入各種藥物從觀察其作用和變化。因此給藥的途徑、制劑和劑量是影響實(shí)驗(yàn)中很重要的問題。如有的激素在肝臟內(nèi)破壞,經(jīng)口給藥就會影響其效果。有些中藥用粗制靜脈注射,因其成分復(fù)雜,如含有鉀離子,可以有降血壓作用,若把這種非特異性降壓作用解釋為特殊性療效就不恰當(dāng)。這類實(shí)驗(yàn)結(jié)果如果用口服或由十二指腸給藥就可鑒別出來。也有些中藥成分在消化道破壞或不被吸收。如枳實(shí)中的升壓有效成分,對羥福林和N-甲基胺只是在靜脈注射時才有療效。有些中藥含有大量鞣質(zhì),體外試gydjdsj.org.cn/shouyi/驗(yàn)有抗菌作用,但在體內(nèi)不被消化道吸收,則沒有抗菌作用。給藥的次數(shù)對一些藥物也有關(guān)系,如雌三醇與細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)結(jié)合的時間非常短,所以,每天一次給藥的效果就比較弱,如將一天劑量分為八次給藥,則效果將大大加強(qiáng)。藥物的濃度和劑量也是一個重要問題,太高的濃度,太大的劑量都會得出錯誤的結(jié)果。如有用1/2LD50腹腔注射某藥物后動物活動減少,認(rèn)為該藥有鎮(zhèn)靜作用,實(shí)際上1/2LD50的劑量已近中毒量,這時動物活動減少,不能認(rèn)為是鎮(zhèn)靜的作用。在動物實(shí)驗(yàn)中常遇到的問題是動物和人的劑量換算。若按體重把人的用量換算給動物則劑量太小,做實(shí)驗(yàn)常得出無效的結(jié)論,或按動物體重?fù)Q算給人則劑量太大。動物和人用藥劑量的換算以體表面積計算比以體重?fù)Q算好一些,但仍需要慎重處理。動物和人用藥劑量換算方法可參考動物實(shí)驗(yàn)基本方法一講。

七、對照問題

在動物實(shí)驗(yàn)中對照問題也是正常重要的問題,常有忽視或錯誤地應(yīng)用對照的情況,從而造成實(shí)驗(yàn)失敗。一般對照的原則是“齊同對比”。對照方法很多,有空白對照、實(shí)驗(yàn)對照、有效(或標(biāo)準(zhǔn))對照、配對對照、組間對照、歷史對照以及正常值對照等。

1.空白對照是在不給任何措施情況下觀察動物自發(fā)變化的規(guī)律。如兔白細(xì)胞數(shù)每天上下午有周期性生物鐘變化。

2.實(shí)驗(yàn)對照是采用與實(shí)驗(yàn)相同操作條件的對照,如給藥實(shí)驗(yàn)中的溶媒、手術(shù)、注射以及觀察撫摸等都可以對動物發(fā)生影響。有人報導(dǎo)針刺狗人中穴對休克、心臟血液動力學(xué)有改變,但采用空白對照(不針刺)是不夠的,應(yīng)該還設(shè)有針刺其它部位或穴部的實(shí)驗(yàn)對照。

3.有效(或標(biāo)準(zhǔn))對照常用于藥物研究。對一新藥的療效可用一已知的有效藥或能引起標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)的藥物做對照,這樣既可考核實(shí)驗(yàn)方法的可靠性,又可通過比較了解新藥的療效和特點(diǎn)。

4.配對對照是同一個體在前后不同時間比較對照期和實(shí)驗(yàn)期的差異,或同一個體的左右兩部分作對照處理和實(shí)驗(yàn)處理的差異,這樣可大大減少抽樣誤差。在實(shí)驗(yàn)中也可用一卵雙胎或同窩動物來做。

5.組間對照是將實(shí)驗(yàn)對象分成兩組或幾組比較其差異。這種對照個體差異和抽樣誤差比較大。組間對照可用交叉對照方法以減少誤差。如觀察某藥物的療效可用兩組狗先分別做一次實(shí)驗(yàn)和對照,再互相交換,以原實(shí)驗(yàn)作為對照組,原對照組作為實(shí)驗(yàn)組重復(fù)第一次實(shí)驗(yàn)所觀察的療效或影響,而且檢查的指標(biāo)和條件要等同。

6.歷史對照與正常值對照,這種對照要十gydjdsj.org.cn/shiti/分慎重,必須要條件、背景、指標(biāo)、技術(shù)方法相同才可進(jìn)行對比,否則將會得出不恰當(dāng)?shù)纳踔铃e誤的結(jié)論。

7.實(shí)驗(yàn)重復(fù)和肯定選用動物一方面要數(shù)量合適,不造成浪費(fèi),另一方面也應(yīng)做必要的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。有此實(shí)驗(yàn)單做一種動物還不夠,應(yīng)當(dāng)重復(fù)做幾種動物。這不僅可以比較不同動物的差別,而且可以在不同動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新問題,提供使用不同指標(biāo)的線索。此外,把一種動物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到其它動物甚至推論到臨床是不正確的,有時是十分危險的。如動脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn),不同動物在血管的結(jié)構(gòu)、病變、α-和β-脂蛋白的比例以及膽固醇的水平各有不同,這樣不僅可以比較一些不同動物病理變化,也可以根據(jù)這些不同的變化尋找生化指標(biāo)與病變形成的關(guān)系,把實(shí)際工作推進(jìn)一步。由于不同種屬動物有不同的功能和代謝特點(diǎn),所以在肯定一個實(shí)驗(yàn)結(jié)果時最好采用兩種以上的動物進(jìn)行比較觀察,其中一種應(yīng)該是非嚙齒類動物。尤其是動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果要外推到人的實(shí)驗(yàn),所選用的動物品種應(yīng)不少于3種,而且其中之一不應(yīng)是嚙齒類動物。常用的生物序列是小鼠——大鼠——狗(或猴)。

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