在第十五章酶免疫測定中已敘述了斑點(diǎn)-ELISA和RIBA兩種斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗，本節(jié)介紹的兩種方法（斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗和斑點(diǎn)免疫層析試驗)是在以上兩種方法的基礎(chǔ)上發(fā)展形成的，均以硝酸纖維素膜為固相載體，以免疫金為結(jié)合物。因其最大特點(diǎn)是簡便快速，故統(tǒng)稱為快速斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗。
斑點(diǎn)免疫滲濾試驗的基本原理是：以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。斑點(diǎn)免疫滲濾試驗最初是從斑點(diǎn)ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來建立的，應(yīng)用的結(jié)合物是酶標(biāo)記的，稱為斑點(diǎn)酶免疫滲濾試驗。90年代初發(fā)展了以膠體金為標(biāo)記物的斑點(diǎn)免疫滲濾試驗（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA)，又名滴gydjdsj.org.cn/shouyi/金免疫測定法（簡稱滴金法)。在滴金法中不需酶對底物的反應(yīng)，更加簡便、快速，在臨床檢驗中應(yīng)用日漸廣泛。
（一)原理
以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為膜所吸附。當(dāng)?shù)渭釉谀ど系臉?biāo)本液體滲濾過膜時，標(biāo)本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無關(guān)蛋白等沒濾出膜片。其后加入的膠體金標(biāo)記也在滲濾中與已結(jié)合在膜上的抗原相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點(diǎn)。
（二)試劑和操作
1．滲濾裝置滲濾裝置是滴金法測定中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水墊料和點(diǎn)加了抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成。塑料小盒可以是多種形狀的，盒蓋的中央有一直徑約0.4～0.8cm的小圓孔，盒內(nèi)墊放吸水墊料，硝酸纖維素膜片安放在正對盒蓋的中央有一直徑約0.40.8cm的小圓孔，盒的墊放吸水塑料，硝酸纖維素膜片安放在正對盒的圓孔下，緊密關(guān)閉盒蓋，使硝酸纖維素膜片貼緊吸水墊料。如此即制備成一滲濾裝置（圖19-1)。塑料小盒的形狀最多見的是扁平的長方形小板，加之滴金法的整個反應(yīng)過程都是在滲濾裝置上進(jìn)行的，因此又常稱滲濾裝置為滴金法反應(yīng)板。
2．試劑盒組成滴金法試劑盒的三個基本試劑成分是滴金法反應(yīng)板、免疫金復(fù)合和洗滌液。為了提供質(zhì)控保證，用于抗原測定的試劑盒還應(yīng)包括抗原參照品，相應(yīng)的檢測抗體的試劑盒應(yīng)有陽性對照品。
3．測定操作以雙抗體夾心法為例，具體步驟如下：
（1)將反應(yīng)板平放于實(shí)驗臺上，于小孔內(nèi)滴加血清標(biāo)本1～2滴，待完全滲入。
（2)于小孔內(nèi)滴加免疫金復(fù)合物試劑1～2滴，待完全滲入。
（3)于小孔內(nèi)滴加洗滌液2～3滴，待完全滲入。
（4)判讀結(jié)果：在膜中央有清晰的淡紅色斑點(diǎn)顯示者判為陽性反應(yīng)；反之，則為陰性反應(yīng)。斑點(diǎn)呈色的深淺相應(yīng)地提示陽性強(qiáng)度。
（三)質(zhì)量控制
滴金法的質(zhì)量控制常采用在硝酸纖維素膜上點(diǎn)加質(zhì)控點(diǎn)的方法。質(zhì)控小圓點(diǎn)多位于反應(yīng)斑點(diǎn)的正下方。雙抗體夾心法的質(zhì)控點(diǎn)最好是相應(yīng)抗原，若該抗原試劑不易制備或價格昂貴時，也可用SPA或針對金標(biāo)抗體的抗抗體來充當(dāng)。間接法的質(zhì)控點(diǎn)采用鹽析法粗提的人IgG最為經(jīng)濟(jì)、方便。
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圖19-1 DIGFA滲濾裝置及操作示意圖
A：操作示意圖B:裝置分解圖
有將包被斑點(diǎn)由圓點(diǎn)改成短線條式的：質(zhì)控斑點(diǎn)橫gydjdsj.org.cn/job/向包被成橫線條，如“－”；反應(yīng)斑點(diǎn)縱向包被成豎線條，如“∣”；兩者相交成“＋”。這樣，陽性反應(yīng)結(jié)果在膜上顯示紅色的正號（＋)，陰性反應(yīng)結(jié)果則為負(fù)號（－)，目視判斷直觀、明了。
（一)原理
斑點(diǎn)免疫層析試驗（dotimmunochromatographicassay，DICA)簡稱免疫層析試驗（ICA)，也以硝酸纖維素膜為載體，但利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般。
（二)試劑和操作
免疫層析試驗以單克隆雙抗體夾心法為例。試驗所用試劑全部為干試劑，多個試劑被組合在一個約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條（圖19-2)，試劑條上端（A)和下端（B)分別粘貼吸水材料，免疫金復(fù)合物干片粘貼在近下端（C)處，緊貼其上為硝酸纖維素膜條。硝酸纖維素膜條上有兩個反應(yīng)區(qū)域，測試區(qū)（T)包被有特異抗體，參照區(qū)（R)包被有抗小鼠IgG。
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圖19-2 免疫層析試驗原理示意圖
測定時將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動，流經(jīng)C處時使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。若標(biāo)本中有待測特異抗原，其時可與免疫金復(fù)合物之抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條（T)。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相小鼠IgG結(jié)合（免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG)，而顯出紅色質(zhì)控線條（R)。反之，陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。
斑點(diǎn)免疫層析試驗在試劑形式和操作步驟上較前述的幾種免疫測定法都更為簡化，只用一個試劑，只有一步操作。
上述兩種試驗的共同特點(diǎn)是：簡便、快速、單份測定、可立等結(jié)果，除試劑外無需任何儀器設(shè)備，且試劑穩(wěn)定。因此特別適用于急診檢驗。但這類試驗不能準(zhǔn)確定量，所以主要限于檢測正常體液中不存在的物質(zhì)（例如診斷傳染病中的抗原或抗體)以及正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)（如HCG等)。目前臨床檢驗中已開展的項目有HCG、抗HCV和抗HIV等。新項目正在不斷發(fā)展中。
