動(dòng)脈粥樣硬化:第五節(jié)　免疫透行射比濁法

一、原理

當(dāng)光線通過一個(gè)渾濁介質(zhì)溶液時(shí)，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法早于1959年Schultre和Schuick等報(bào)道應(yīng)用于血漿蛋白與其抗體結(jié)合后形成復(fù)合物，導(dǎo)致濁度的改變，再進(jìn)行透射比濁測定，一般采用抗體對抗原定量的透射比濁法，稱為免疫透射比濁法。其原理是，利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，通過測定復(fù)合物形成量的多少對抗原或抗體進(jìn)行定量的方法。在介質(zhì)溶液中，抗原與特異性抗體在一定條件下才能形成復(fù)合物，一定的條件包括：①對抗體的要求，作為體液或組織中蛋白質(zhì)種類很多，若要快速特異檢測，要求有單價(jià)特異抗體才能與抗原形成復(fù)合物。某一種蛋白質(zhì)，有其特異抗體才能與該抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物進(jìn)行定量，若抗體不純混雜有另一種或兩種少量的抗體，這種免疫復(fù)合物就不是單一復(fù)合物而是大雜燴，結(jié)果偏高；②抗原抗體比例適當(dāng)，因免疫復(fù)合物形成有三個(gè)階段，第一階段是復(fù)合物形成抗原抗體復(fù)合物；第二階段是初步形成抗原抗體復(fù)合物，此階段是復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)；第三階段是復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀。只有在抗原與抗體等價(jià)時(shí)即無過剩抗體，此時(shí)，復(fù)合物的結(jié)合與解離處于平衡狀態(tài)，其混濁程度達(dá)高峰。在抗體過量時(shí)，隨抗原量的增加而復(fù)合物形成也增加，其測定只能在反應(yīng)曲線的左側(cè)進(jìn)行（見圖18-4)；③一般要求溶液中有非離子性親水多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成，如聚二乙醇6000等。溶液pH為6.5～8.0之間為宜。載脂蛋白有形成兩性螺旋片（amphipathic helix)的特性，對脂質(zhì)（特別是磷脂)有高度親和力，與脂質(zhì)結(jié)合后有時(shí)會掩蓋抗原位點(diǎn)或構(gòu)象改變，可以部分或完全喪失對抗血清的特異反應(yīng)。為此，載脂蛋白檢測過程中有必要先暴露抗原位點(diǎn)，所用試劑有表面活性劑，尿素，鹽酸胍和吐溫等解離蛋白劑，或用四甲基脲脫脂或有機(jī)溶劑脫脂等暴露抗原決定簇等方法，血清脂蛋白顆粒中的載脂蛋白，能在短時(shí)間內(nèi)形成抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行定量；④抗原不能過量，因?yàn)榭乖�過量，抗原抗體復(fù)合物形成不但不增加，反而會減少，光散射或光吸收減少，檢測結(jié)果反而偏低。

圖18-4 抗原抗體反應(yīng)曲線

在免疫比濁過程中，由于抗原抗體結(jié)合的三過程，從而導(dǎo)致光密度與濃度之間不呈線性關(guān)系，一般是3次方程曲線關(guān)系。若將抗原與抗體兩個(gè)變量之間的變動(dòng)特征恰當(dāng)?shù)胤从吵鰜恚�需要�?jīng)過3次方程擬合成近似直線化的曲線方程，再進(jìn)行運(yùn)算，免疫比濁中，采用終點(diǎn)法或速率法，用5個(gè)或7個(gè)不同梯度進(jìn)行定標(biāo)，經(jīng)3次曲線方程求出一條能反映真實(shí)情況的濃度與光密度的關(guān)系曲線方程，才能作為定量的工作曲線。

二、血清ApoAⅠ（B100)透射比濁測定法

脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒，分散于溶液介質(zhì)中，在一定波長下測定其混濁程度，進(jìn)行ApoAⅠ（B₁₀₀)的定量測定。

（一)手工操作

1．原理

血清ApoAⅠ（B₁₀₀)+抗人ApoAⅠ（B₁₀₀)→抗原抗體復(fù)合物→測定光密度

2．試劑（伊利康)

（1)Apo緩沖液（RⅠ)，含4%PEG6000和表面活性劑

www.med126.com（2)羊抗人ApoAⅠ（B₁₀₀)抗體液（RⅡ)：監(jiān)用前取抗血清200μl，加0.9%NaCl液700μl，混勻，待用，置冰箱一周內(nèi)有效。

（3)ApoAⅠ（B₁₀₀)參考血清（RⅢ)

3．操作

（1)按ApoAⅠ抗血清液或ApoB₁₀₀抗血清100μl，加相應(yīng)的Apo緩沖液0.9ml的比例混合成單一試劑（Apo抗體液)。最好臨用前配制當(dāng)天用量。

（2)各試劑用量如下表

混勻各管，37℃保溫10min，波長340min，于半自動(dòng)分析儀上先www.med126.com吸入空白管液，再吸入標(biāo)準(zhǔn)管，儀器根據(jù)光密度及參考值得出一換算系數(shù)，再吸入測定管，儀器內(nèi)根據(jù)光密度及系數(shù)進(jìn)行運(yùn)算，打印結(jié)果。

（3)定標(biāo)方法，根據(jù)免疫比濁法原理，應(yīng)取多點(diǎn)（3～9點(diǎn))，按y=a+bx+cx²+dx³的3次方程回歸曲線進(jìn)行定標(biāo)，制作參考工作曲線。

①校正工作曲線的繪制：

配制抗血清稀釋工作液：按RⅠ試劑0.9ml，加RⅡ試劑100μl的比例（Apo抗體液)混勻，待用。

制備5點(diǎn)校正液：取RⅢ（參考血清)，用0.9%生理鹽水倍比稀釋成5個(gè)濃度，第5管為原參考血清濃度，其他4管分別為第5管的1/2、1/4、1/8、1/16（或濃度為0即0.9%NaCl)。

表18-20 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的各管（點(diǎn))濃度

混勻各管，置37℃水浴保溫10min，按程序上機(jī)作工作曲線。

②標(biāo)本測定：吸待測血清（測定管)5μl，加上述稀釋抗血清工作液1.0ml，于37℃水浴保溫10min，上機(jī)讀數(shù)，打印結(jié)果。

③如測定值超過工作曲線上限值，儀器會打印顯示“過高”，此時(shí)，將待測標(biāo)本稀釋1倍再測。

④每批號的抗血清應(yīng)作一次多點(diǎn)定標(biāo)，即測定標(biāo)本的抗血清應(yīng)與定標(biāo)的抗血清是同一批號抗血清。

（二)生化分析儀測定

1．原理

脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒分散于溶液介質(zhì)中，在一定波長下測定其混濁程度，進(jìn)行ApoAⅠ（B₁₀₀)的定量測定。

ApoAⅠ（B₁₀₀)+抗人ApoAⅠ（B₁₀₀)→抗原抗體復(fù)合物→測定吸光光密度

2．雙試劑單（雙)波長法

（1)試劑（溫州伊利康)

RⅠ：Apo緩沖液，含4% PEG6000和表面活性。

RⅡ：羊抗人ApoA（B₁₀₀)稀釋抗血清

RⅢ：Apo定值血清

（2)各試劑及標(biāo)本用量如下表：

（3)定標(biāo)：以5點(diǎn)Apo梯度濃度，采用免疫定標(biāo)法按表18-21參數(shù)上機(jī)定標(biāo)，如圖18-5所示。

圖18-5 ApoAⅠ 五點(diǎn)免疫定標(biāo)曲線圖（以CL-7200儀器為例)

（4)上機(jī)（終點(diǎn)法或兩點(diǎn)法)

（5)說明：①Apo測定的光密度從340～700nm范圍都可采用，多用340nm；②國內(nèi)已有的Apo試劑盒均無需處理；③血清標(biāo)本也無需處理，均可直接檢測；④本法適用于多種類型的全自動(dòng)生化分析儀檢測，自動(dòng)扣除空白，快速準(zhǔn)確；⑤效價(jià)不同的抗血清，其用量應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

(5)計(jì)算△A=A2-A1,以△A值采用免疫定標(biāo)自動(dòng)運(yùn)算。

3.單一試劑單波長法

(1)試劑同雙試劑法

(2)標(biāo)本及試劑用量:按ApoAⅠ抗血清液或ApoB抗血清液(RⅡ)100μl,加相應(yīng)的Apo緩沖液(RⅠ)0.3ml的比例混合成單一試劑(Apo抗體液)。最好臨用前配制當(dāng)天用量,此抗體液置2～8℃保存一周有效。

（3)定標(biāo)：按五點(diǎn)梯度稀釋定值血清（見表18-21)，以終點(diǎn)法或兩點(diǎn)法進(jìn)行免疫定標(biāo)。

（4)按以下步驟操作：

（5)以△A=A2-A1值按免疫定標(biāo)自動(dòng)運(yùn)算。

（6)說明：①該法一般用半自動(dòng)生化分析儀；②通過設(shè)延遲時(shí)間以扣除空白；③RⅠ、RⅡ試劑以臨用時(shí)混合為好，未用完的混合試劑應(yīng)置于2～8℃冰箱保存，只允許使用一周；④血清標(biāo)本無需再處理。

4.ApoAⅠ、AⅡ、B、CⅡ、CⅢ和E的全自動(dòng)生化分析儀檢測的有關(guān)數(shù)據(jù)。

（1)上機(jī)參數(shù)（以CL-7200型為例)如表18-21所示。

表18-21 自動(dòng)生化分析儀檢測Apo有關(guān)參數(shù)

（2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備參數(shù)如表18-22所示。

表18-22 生化分析儀檢測Apo的定標(biāo)濃度

5．單一試劑和雙試劑檢測方法的比較

單一試劑和雙試劑在全自動(dòng)生化分析儀測定的光密度變化過程，如圖18-6所示。

從理論上考慮任何一種生化測定方法的試劑，臨用時(shí)混合最好，可以消除試劑各種成份的自身化學(xué)變化和相互影響。而在實(shí)際工作中，是不可能的，只能是將幾種不會起化學(xué)反應(yīng)而又無相互影響的試劑配制成2～4種，臨用時(shí)按一定比例配制使用。臨床化學(xué)試劑盒，目前主要以1或2種試劑形式供醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)使用，即單一試劑和雙試劑兩種形式。

筆者認(rèn)為雙試劑比單一試劑好，尤其是含酶試劑和免疫試劑以雙試劑包裝形式為好，有利于對酶的活性或抗體效價(jià)的保存。單一試劑是所有試劑混合在一起，存放過程中，有可能因化學(xué)物質(zhì)的存在而損害試劑中的工具酶或抗體，存放時(shí)間越長，損害可能性越大，然而雙試劑不存在這一問題。

對脂質(zhì)的測定雙試劑法更顯其優(yōu)越性，因?yàn)檠�清中脂質(zhì)與載脂蛋白是以脂蛋白的形式存在，當(dāng)測定試劑與血清標(biāo)本混合后，首先解聯(lián)脂蛋白，讓其釋放出脂質(zhì)和載脂蛋白，。作為免疫測定試劑還兼有使載脂蛋白抗原決定簇暴露的作用。當(dāng)R1試劑作用完后，加進(jìn)第二試劑（R2)后，使其抗體適應(yīng)抗原決定簇的要求，達(dá)到抗原抗體結(jié)構(gòu)呈完全的互補(bǔ)狀態(tài)，從而產(chǎn)生最大的抗原抗體結(jié)合量，達(dá)到定量的目的。雙試劑測定法，既能自動(dòng)扣去空白，又能使化學(xué)反應(yīng)快速進(jìn)行，從而迅速地完成檢測的全過程。

圖18-6 單雙試劑法反應(yīng)過程的光密度變化曲線圖

A：雙試管法；B：為單一試劑法

（賀小玲　胡漢寧)