武漢大學(xué)微生物講義

                       實(shí)驗(yàn)三 

[目的要求]

    通過(guò)對(duì)高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基的配制、掌握配制合成培養(yǎng)基的一般方法。

[實(shí)驗(yàn)原理]

    高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基是用來(lái)培養(yǎng)和觀察放線菌形態(tài)特征的合成培養(yǎng)基。如果加入適量的抗菌藥物(如各種抗生素、酚等)，則可用來(lái)分離各種放線菌。此合成培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是含有多種化學(xué)成分已知的無(wú)機(jī)鹽，這些無(wú)機(jī)鹽可能相互作用而產(chǎn)生沉淀。此外，合成培養(yǎng)基有的還要補(bǔ)加微量元素。

[教學(xué)內(nèi)容]

    高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基的制備

實(shí)驗(yàn)四 

[目的要求]

通過(guò)對(duì)分離真菌的馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基配制、掌握選擇培養(yǎng)基的配制方法，并確選擇的原理。

[實(shí)驗(yàn)原理]

馬丁氏培養(yǎng)基是一種用來(lái)分離真菌的選擇性培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的特點(diǎn)是培養(yǎng)基中加入的孟加拉紅和鏈霉素能有效的抑制細(xì)菌和放線功菌的生長(zhǎng)，而對(duì)真菌無(wú)抑制作用，因而真菌在這種培養(yǎng)基上可以得到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，從而達(dá)到分離真菌的目的。

[教學(xué)內(nèi)容]

     馬丁氏培養(yǎng)基的制備

實(shí)驗(yàn)五 

[目的要求]

1.了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍。

2.學(xué)習(xí)干熱滅菌的操作技術(shù)。

[實(shí)驗(yàn)原理]

干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固緩慢。

[教學(xué)內(nèi)容]

干熱滅菌

實(shí)驗(yàn)六

[目的要求]

1.了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。

2.學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的操作方法。

[實(shí)驗(yàn)原理]

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。

[教學(xué)內(nèi)容]

高壓蒸汽滅菌

實(shí)驗(yàn)七 

[目的要求]

了解紫外線滅菌的原理和方法

[實(shí)驗(yàn)原理]

紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的。波長(zhǎng)為200-300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長(zhǎng)一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)制主要是因?yàn)樗�誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成［O］，再使O2氧化生成自臭氧(O3)或使水(H2O)氧化生成過(guò)氧化氫(H2O2)。O3和H2O2均有殺菌作用。

[教學(xué)內(nèi)容]

紫外線滅菌

實(shí)驗(yàn)八

[目的要求]

了解過(guò)濾除菌的原理；掌握微孔濾膜過(guò)濾除菌的方法。

[實(shí)驗(yàn)原理]

過(guò)濾除菌是通過(guò)機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過(guò)濾除菌。

[教學(xué)內(nèi)容]

微孔濾膜過(guò)濾除菌

實(shí)驗(yàn)九 

[目的要求]

掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)。

[實(shí)驗(yàn)原理]

從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物的分離與純化。常用的方法有：1).簡(jiǎn)易單細(xì)胞挑取法; 2).平板分離法。

土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。

[教學(xué)內(nèi)容]

微生物的分離與純化

實(shí)驗(yàn)十 

[目的要求]

1.了解不同的微生物在斜面上、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特征。

2.進(jìn)一步熟練和掌握微生物無(wú)菌操作技術(shù)。

[實(shí)驗(yàn)原理]

微生物的培養(yǎng)特征是指微生物在固體培養(yǎng)基上、半固體和液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后所表現(xiàn)出的群體形態(tài)特征。不同的微生物有其固有的培養(yǎng)特征，這些特征一般用固體、半固體和液體培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)微生物的培養(yǎng)特征時(shí)，接種和培養(yǎng)過(guò)程中必須保證不被其他微生物所污染，因此，除工作環(huán)境要求盡可能地避免或減少雜菌污染外，熟練地掌握各種無(wú)菌操作接種技術(shù)是很重要。

[教學(xué)內(nèi)容]

微生物的培養(yǎng)特征

                          實(shí)驗(yàn)十一

[目的要求]

1.學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法。

2.初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征。

3.鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法和無(wú)菌操作技術(shù)。

[實(shí)驗(yàn)原理]

簡(jiǎn)單染色法是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡(jiǎn)便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，這是因?yàn)椋涸谥行浴�堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷(酸性染料電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷)，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著。染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。常用作簡(jiǎn)單染色的染料有：美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。

當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時(shí)可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。

[教學(xué)內(nèi)容]

細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法

實(shí)驗(yàn)十二

[目的要求]

1.  學(xué)習(xí)并初步掌握革蘭氏染色法。

2.  了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。

[實(shí)驗(yàn)原理]

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain Gram氏創(chuàng)立的，而后一些學(xué)者在此礎(chǔ)上作了某些改進(jìn)。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。

[教學(xué)內(nèi)容]

革蘭氏染色法

                         實(shí)驗(yàn)十三

[目的要求]

1.  學(xué)習(xí)并初步掌握鞭毛染色法，觀察細(xì)菌鞭毛的形態(tài)特征。

2.  學(xué)習(xí)用壓滴法和懸滴法觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。

[實(shí)驗(yàn)原理]

鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)“器官”，細(xì)菌是否具有鞭毛，以及鞭毛著生的位置和數(shù)目是細(xì)菌的一項(xiàng)重要形態(tài)特征。細(xì)菌的鞭毛很纖細(xì)，其直徑通常為0.01～0.02微米，所以，除了很少數(shù)能形成鞭毛束(由許多根鞭毛構(gòu)成)的細(xì)菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛束的存在外，一般細(xì)菌的鞭毛均不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察到，而只能用電子顯微鏡觀察。要用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌的鞭毛，必須用鞭毛染色法。

[教學(xué)內(nèi)容]

    鞭毛染色法及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的觀察

實(shí)驗(yàn)十四

[目的要求]

1．  學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌形態(tài)的基本方法。

2．  初步了解放線菌的形態(tài)特征。

[實(shí)驗(yàn)原理]

放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。常見放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的叫基內(nèi)菌絲(簡(jiǎn)稱“基絲”)，基絲生長(zhǎng)到一定階段還能向空氣中生長(zhǎng)出氣生菌絲(簡(jiǎn)稱“氣絲”)，并進(jìn)一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子。為了觀察放線菌的形態(tài)特征，人們?cè)O(shè)計(jì)了各種培養(yǎng)和觀察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長(zhǎng)狀態(tài)下的形態(tài)特征。本實(shí)驗(yàn)介紹其中幾種常用方法。

[教學(xué)內(nèi)容]

放線菌形態(tài)的觀察

實(shí)驗(yàn)十五

[目的要求]

學(xué)習(xí)并掌握用測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法。增強(qiáng)微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識(shí)。

[實(shí)驗(yàn)原理]

微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小

的測(cè)定在顯微鏡下，借助于特殊的測(cè)量工具—測(cè)微尺，包括目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。

[教學(xué)內(nèi)容]

  微生物大小的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)十五 

[目的要求]

1.  觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。

2.  掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)菌的區(qū)別。

[實(shí)驗(yàn)原理]

酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物，其大小通常比常見細(xì)菌大幾倍甚至十幾倍。

美藍(lán)是一種無(wú)毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無(wú)色。用美藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型，因此，具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無(wú)色的、而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，借此即可對(duì)酵母菌的死細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行鑒別。

[教學(xué)內(nèi)容]

酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒別

                         實(shí)驗(yàn)十六

[目的要求]

學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法；了解四類常見霉菌的基本形態(tài)特征。

[實(shí)驗(yàn)原理]

霉菌可產(chǎn)生復(fù)什分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長(zhǎng)到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態(tài)特征是識(shí)別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線菌粗得多(約為3～10微米)，常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。

[教學(xué)內(nèi)容]

霉菌的形態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)十七

  [目的要求]

1.明確血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理

2.掌握使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。

[實(shí)驗(yàn)原理]

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。

[教學(xué)內(nèi)容]

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

                      實(shí)驗(yàn)十八 

[目的要求]

學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法。

[實(shí)驗(yàn)原理]

平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見的菌落。為了清楚地闡述平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony -forming units, cfu)而不以絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品的活菌含量。

[教學(xué)內(nèi)容]

平板菌落計(jì)數(shù)法

實(shí)驗(yàn)十九 

[目的要求]

1.了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理

2.學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計(jì)數(shù)法的操作方法。

[實(shí)驗(yàn)原理]

當(dāng)光線通過(guò)微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過(guò)量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測(cè)出(圖Ⅷ-4)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測(cè)定光密度，作出光密度--菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，對(duì)于不同微生物的菌懸液進(jìn)行光電比濁計(jì)數(shù)應(yīng)采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

[教學(xué)內(nèi)容]

光電比濁計(jì)數(shù)法

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