| 公開(公告)號 | CN1324146C |
| 公開(公告)日 | 2007.07.04 |
| 申請(專利)號 | CN200510037779.5 |
| 申請日期 | 2005.02.01 |
| 專利名稱 | BCR-ABL融合基因(P210bcr/ab1mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒 |
| 主分類號 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號 | C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/25(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 合肥中科大生物技術(shù)有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 程 民;魏海明;田志剛;耿 燕 |
| 地址 | 230027安徽省合肥市金寨路96號科大西區(qū)生命科學(xué)學(xué)院 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 合肥華信專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 余成俊 |
| 國省代碼 | 安徽;34 |
| 主權(quán)項(xiàng) | BCR-ABL融合基因(P210bcr/abl)mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征為：它包含細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II、無RNA酶的水、RNA分離柱、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液、PCR反應(yīng)液、探針、標(biāo)準(zhǔn)品、對照品；以上各種溶液所用溶劑均為水； (1)、細(xì)胞裂解液I包含0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、0.1mol/L氯化鈉、0.05mol/L氯化鎂、水；其中0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液在25℃條件下，pH值為7.6； (2)、細(xì)胞裂解液II包含3mol/L異硫氰酸胍、2mol/L鹽酸胍、0.3mol/L醋酸鈉、重量體積比為0.2％的十二烷基硫酸鈉、水；其中0.3mol/L醋酸鈉溶液pH值為5.2； (3)、RNA洗滌緩沖液I包含0.2mol/L醋酸鈉、0.1mol/L氯酸鈉、0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、水；其中0.2mol/L醋酸鈉溶液pH值為5.2；0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液在25℃條件下，pH值為7.5； (4)、RNA洗滌緩沖液II包含1.2mol/L檸檬酸鈉、0.5mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、水；其中0.5mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液在25℃條件下，pH值為7.5； (5)、無RNA酶的水制備方法為：向去離子水加入焦碳酸二乙酯，至體積終濃度為0.05％，22-25℃放置10-12小時(shí)后，121℃，20min高壓，22-25℃放置備用； (6)、RNA分離柱是一種硅膠柱，可以特異性結(jié)合RNA，并可用水洗脫RNA，達(dá)到分離純化RNA的目的； (7)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液包含9.1μmol/L Oligo(dT)12-18、3.6U/μl RNA酶抑制劑、72.7mmol/L二硫蘇糖醇、182mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、273mmol/L氯化鉀、11mmol/L氯化鎂、水；其中182mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液在25℃條件下，pH值為8.3； (8)、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液包含20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鈉、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫蘇糖醇、體積比為50％的甘油、體積比為0.01％的Nonidet p-40、200U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶、水；其中20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液在25℃條件下，pH值為7.5； (9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，為其鈉鹽-水溶液，pH7.0-7.5，四種dNTP濃度均為10mmol/L； (10)、PCR反應(yīng)液包含18.5mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、2.78mmol/L氯化鎂、92.6mmol/L氯化鉀、0.37μmol/L上下游引物、0.1U/μl Taq酶、400nmol/L dATP、400nmol/L dCTP、400nmol/L dGTP、400nmol/LdTTP、水；其中18.5mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液在25℃條件下，pH值為8.3； 上下游引物序列分別為： P1：5’-AGC ATT CCG CTG ACC ATC A-3’， P2：5’-GCG TGA TGT AGT TGC TTG GGA C-3’ (11)、探針為熒光標(biāo)記探針，其序列為： 5’-FAM-TTT GGG CTT CAC ACC ATT CCC CAT TG-TAMRA-3’ 探針的濃度為：2μmol/L，TE溶液溶解，TE溶液的組成為10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水。 (12)、標(biāo)準(zhǔn)品的序列為： 1 AGCATTCCGC TGACCATCAA TAAGGAAGAT GATGAGTCTC CGGGGCTCTA 51 TGGGTTTCTG AATGTCATCG TCCACTCAGC CACTGGATTT AAGCAGAGTT 101 CAAAAGCCCT TCAGCGGCCA GTAGCATCTG ACTTTGAGCC TCAGGGTCTG 151 AGTGAAGCCG CTCGTTGGAA CTCCAAGGAA AACCTTCTCG CTGGACCCAG 201 TGAAAATGAC CCCAACCTTT TCGTTGCACT GTATGATTTT GTGGCCAGTG 251 GAGATAACAC TCTAAGCATA ACTAAAGGTG AAAAGCTCCG GGTCTTAGGC 301 TATAATCACA ATGGGGAATG GTGTGAAGCC CAAACCAAAA ATGGCCAAGG 351 CTGGGTCCCA AGCAACTACA TCACGC 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為：106copies/μl，TE溶液溶解，TE溶液的組成為10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水； (13)、對照品分為陽性對照品與陰性對照品，陽性對照品為有P210bcr/abl cDNA的樣品，濃度為104copies/μl，陰性對照品為外周血總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種BCR-ABL融合基因(P210bcr/ablmRNA)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含總RNA提取液(細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II和無RNA酶的水)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，dNTP混合物，逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR反應(yīng)液，探針，陽性標(biāo)準(zhǔn)品，對照品。本發(fā)明通過對新鮮抗凝外周血提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得到cDNA，再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)，可準(zhǔn)確定量檢測標(biāo)本中P210bcr/abl的mRNA的表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于臨床及科研中檢測慢性粒細(xì)胞性白血病患者的外周血中P210bcr/ablmRNA的表達(dá)，為慢性粒細(xì)胞性白血病的早期診斷、復(fù)發(fā)、治療方案的確定及預(yù)后的判斷提供重要的參考依據(jù)。 |
| 國際公布 |
