| 公開(公告)號 | CN1119352C |
| 公開(公告)日 | 2003.08.27 |
| 申請(專利)號 | CN98110844.X |
| 申請日期 | 1998.05.15 |
| 專利名稱 | 人血清白蛋白在畢赤酵母中的表達與純化 |
| 主分類號 | C07K14/765 |
| 分類號 | C07K14/765;C12N1/19;//C12N1/19,C12R1:84 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所;上海第一生化藥業(yè)公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 袁中一;邱榮德;吳祥甫;李士云;夏其昌;儲瑞藹 |
| 地址 | 200031上海市岳陽路320號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 上海新天專利代理有限公司 |
| 代理人 | 王巍 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項 | 一種高表達人血清白蛋白的巴斯德畢赤酵母重組細胞的構(gòu)建表達和純化方法，其特征在于該方法包括下列步驟：一、人血清白蛋白cDNA的獲得：(1)人胚肝細胞總RNA的抽提從中國人胚肝細胞中抽提總RNA；(2)pre-HSA cDNA合成和PCR體外擴增根據(jù)已知天然HSA基因5’和3’端序列，設(shè)計引物：引物1：5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC3’引物2：5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC3’以抽取的人肝白細胞總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成人血清白蛋白pre-HSA cDNA；(3)所構(gòu)建基因5’端含一BamHI位點與ATG之間含一Kozak序列5’-CCACC-3’，3’端緊接終止密碼子含一EcoRIa位點；二、HSA在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的表達(1)重組表達質(zhì)粒pPKQ-HSA的構(gòu)建：將PUC19-HSA克隆載體中pre-HSA基因片段用BamHI和EcoRI雙酶切下，1％瓊脂糖電泳分離，并用酚/氯仿回收。將約2Kb的pre-HSA基因回收片段，與用相同酶切的pPIC3.5K表達載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆，采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，所得質(zhì)粒DNA用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定出重組質(zhì)粒pPKQ-HAS；(2)表達質(zhì)粒pPIC9-HSA和pPIC9k-HSA的構(gòu)建設(shè)計引物3：5’CGCTCGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA3’用引物3和引物1從PUC19-HSA上PCR擴增HSA cDNA片段，酚/氯仿抽提PCR產(chǎn)物后，用XhoI和EcoRI酶切回收，再與用相同酶切的pPIC9質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，所得質(zhì)粒DNA用XhoI和EcoRI雙酶切初步鑒定重組質(zhì)粒pPIC9-HAS；取4個經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切初步鑒定的重組克隆，制備高純度質(zhì)粒DNA，采用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer(Invitrogen)，測定重組質(zhì)粒HSA cDNA兩端序列，結(jié)果有三個含完全正確的閱讀框，經(jīng)測序驗證的pPIC9-HSA質(zhì)粒用BamHI和EcoRI酶切并回收含HSA基因片段，與用相同酶切的pPIC9k質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1感受態(tài)細胞，涂布氨芐青霉素板篩選陽性克隆，采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA，所得質(zhì)粒DNA用XhoI和EcoRI雙酶切鑒定得重組質(zhì)粒pPIC9k-HAS；(3)重組質(zhì)粒pPKQ-HSA轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞GS115(his4Mut+)將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA用SalI或BglII酶切線性化，同時將空載pPIC3.5k和pPIC9k質(zhì)粒相同酶切線性化，酚/氯仿抽提回收并溶解于無菌水中，電轉(zhuǎn)化GS115細胞，涂布含不同濃度G418的YPD平板，獲得不同G418抗性的陽性克隆，經(jīng)MD平板驗證his+表型獲得GS115/HSA重組克隆S1B119；(4)重組克隆Pichia pastoris GS115/HSA-S1B119株細胞的表達將篩選出的GS115/HSA重組細胞接種3ml YPD試管，30℃300rpm培養(yǎng)過夜，再以0.2％～0.5％接種量接種50ml BMGy，30℃，300rpm培養(yǎng)至OD600 4～7，離心收集菌體懸于15ml含甲醇的BMMY培養(yǎng)液中，置20-30℃搖床誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24hr加甲醇至0.5ml/L，定時取樣，經(jīng)4℃離心，上清加入PMSF至1mM，-20℃凍存；三、表達HSA的分離純化(1)中空纖維柱將2L低密度誘導(dǎo)發(fā)酵液除去細胞后，用截留分子量10KDa-50KDa的中空纖維柱除去低于5OKDa的雜質(zhì)并使?jié)饪s到0.2L濃縮液，HSA收率≥95％；(2)脫色濃縮發(fā)酵液經(jīng)50℃保溫后，加入3％活性炭或732等脫色樹脂處理10分鐘后離心除去，得脫色濃縮液；(3)pharose疏水柱分離濃縮發(fā)酵液或脫色濃縮液中加入固體(NH4)2SO4直至達20％終濃度，并流過20％(NH4)2SO4平衡的Phenyl-Sepharose柱，上樣后用平衡液洗滌至流出液OD280＜0.01，再改用水洗脫，收集用水洗脫的HSA蛋白，收率≥95％；(4)親和層析除去雜蛋白①無HSA發(fā)酵液抗血清-Sepharose的制備：由1所得濃縮發(fā)酵液流經(jīng)抗HSA抗體-Sepharose以除去HAS，將無HSA發(fā)酵液制得的抗血清，通過醛基結(jié)合于Sepharose；②疏水層析純化得到的水洗脫峰通過“無HSA發(fā)酵液的抗血清”親和柱，收集未吸附的蛋白峰為HSA，回收率≥98％；(5)超濾脫鹽將親和層析流出蛋白峰經(jīng)截留分子量10KDa中空纖維或超濾膜組件中脫鹽，可得純度≥99％的HSA，回收率≥98％；(6)真空冷凍干燥將脫鹽后的HSA溶液真空冷凍干燥得到HSA樣品。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種人血清白蛋白在畢赤氏酵母(Pichia pastors)中的表達與純化方法。本發(fā)明的方法特征在于重組表達質(zhì)粒pPKQ-HSA的構(gòu)建和表達HSA的高效分離純化。用該方法獲得的樣品純度高于99％。 |
| 國際公布 |
