| 公開(公告)號 | CN1453360A |
| 公開(公告)日 | 2003.11.05 |
| 申請(專利)號 | CN02125687.X |
| 申請日期 | 2002.07.29 |
| 專利名稱 | 一種構(gòu)建獨(dú)特調(diào)節(jié)方式下特異性殺滅HIV感染細(xì)胞的新型重組HIV載體的方法 |
| 主分類號 | C12N15/86 |
| 分類號 | C12N15/86;C12N7/01 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | 2002.4.22 CN 02117253.6 |
| 申請(專利權(quán))人 | 王勝軍 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 王勝軍 |
| 地址 | 300202天津市河西區(qū)瓊洲道云景大廈2號樓3403 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 天津;12 |
| 主權(quán)項 | 一種構(gòu)建獨(dú)特調(diào)節(jié)方式下特異性殺滅HIV感染細(xì)胞的新型重組HIV載體的方法，其特征在于利用HIV(主要指HIV-1型的野生型)基因組表達(dá)產(chǎn)物的3種特異性調(diào)節(jié)方式：①Rev蛋白調(diào)節(jié)方式。②蛋白酶調(diào)節(jié)方式。③Rev蛋白和蛋白酶雙重調(diào)節(jié)方式。Rev蛋白特異性調(diào)節(jié)方式，指在構(gòu)建新型重組HIV載體過程中，將CRS(順式作用阻抑序列)與RRE(順式作用抗阻抑序列)和(或)NRS(核阻留序列)等的DNA功能序列插入以供目的基因等外源性基因表達(dá)的重組HIV載體各自相應(yīng)的合適位置，依賴與HIV的Rev蛋白特異的相互作用而發(fā)揮Rev蛋白重要的調(diào)節(jié)功能。在HIV感染細(xì)胞內(nèi)，由于HIV基因組早期表達(dá)的Rev蛋白與RRE相互作用克服CRS的阻抑作用，同時Rev蛋白與NRS的相互作用，將未經(jīng)剪切的病毒RNA運(yùn)出細(xì)胞核。因此在Rev蛋白質(zhì)所獨(dú)有的作用下，HIV基因由早期(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白mRNA)向晚期(轉(zhuǎn)錄HIV結(jié)構(gòu)蛋白mRNA)轉(zhuǎn)化，其結(jié)果產(chǎn)生HIV結(jié)構(gòu)蛋白組裝病毒顆粒。在HIV感染細(xì)胞內(nèi)，Rev蛋白同時也會與新型重組HIV載體中的RRE與CRS和(或)NRS相互作用，促進(jìn)毒性蛋白編碼基因順利表達(dá)強(qiáng)大毒性蛋白殺滅HIV感染細(xì)胞和HIV。在正常細(xì)胞內(nèi)，由于不存在HIV的Rev蛋白，因此新型重組HIV載體目的基因在CRS與RRE和(或)NRS獨(dú)特的作用影響下，即使存在很低水平的毒性蛋白基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也將停留在細(xì)胞核內(nèi)，最終被降解，而不會有毒性蛋白產(chǎn)生(注：本發(fā)明不涉及HIV的LTR與Tat蛋白和Tev蛋白之間的相互作用，因為這是本發(fā)明與其它重組病毒載體共用的調(diào)節(jié)方式)。蛋白酶特異性調(diào)節(jié)方式，指構(gòu)建新型重組HIV載體過程中，在外源性目地基因的一側(cè)或兩側(cè)連接上HIV蛋白酶特異性識別序列和酶切位點(diǎn)的編碼基因片斷，也可將gag或pol的某一特定產(chǎn)物編碼基因或基因片段以合適位點(diǎn)與新型重組HIV載體的目地基因相連接(注：gag或pol本身含有蛋白酶識別序列和酶切位點(diǎn))。在HIV感染細(xì)胞內(nèi)，HIV基因組晚期表達(dá)的蛋白酶將pol蛋白切割成幾個功能酶，也將Gag蛋白前體切割成多個蛋白質(zhì)及多肽，最終裝配成熟的病毒顆粒。在HIV感染細(xì)胞內(nèi)，蛋白酶同時也會特異性將新型重組HIV載體編碼基因表達(dá)的蛋白前體或某一特定聚蛋白切開，加工形成具有生物活性的強(qiáng)大毒性蛋白，介導(dǎo)殺滅HIV感染細(xì)胞和HIV。而在正常細(xì)胞內(nèi)，新型重組HIV載體產(chǎn)生的毒性蛋白前體或某一特定聚蛋白，由于沒有HIV蛋白酶的特異性結(jié)合和酶解作用，而只能是無生物學(xué)活性的無功能產(chǎn)物。Rev蛋白和蛋白酶雙重調(diào)節(jié)方式，即從轉(zhuǎn)錄水平到翻譯后加工水平對包括毒性蛋白編碼基因在內(nèi)的外源性基因產(chǎn)物，在成熟過程的不同階段發(fā)揮特異性調(diào)節(jié)功能，其對HIV感染細(xì)胞和正常細(xì)胞作用機(jī)理如同前述或說明書。在構(gòu)建新型重組HIV載體時，可將RRE、CRS、NRS以及蛋白酶特異性識別序列和酶切位點(diǎn)的相應(yīng)基因片斷，以合適位置插入或與外源性基因相連接而克隆其中�？隙〞卸喾N不同的HIV載體構(gòu)建方式，外源性目的基因表達(dá)效率也會因此不同，但都會產(chǎn)生一個共同結(jié)果。即在表達(dá)水平非常低的情況下，如僅1～幾個毒性蛋白分子表達(dá)，也會殺死HIV感染細(xì)胞和HIV而不會損傷正常細(xì)胞。這就是本發(fā)明構(gòu)建新型重組HIV載體與目前構(gòu)建的攜帶自殺基因的各種重組病毒載體的不同之處。 |
| 摘要 | 一種構(gòu)建獨(dú)特調(diào)節(jié)方式下特異性殺滅HIV感染細(xì)胞的新型重組HIV載體的方法：基因療法是治療艾滋病毒(HIV)感染和艾滋病的根本手段，而構(gòu)建攜帶強(qiáng)大毒性蛋白編碼基因的新型重組HIV載體(即僅表達(dá)1～幾個毒性蛋白就足以殺死HIV感染細(xì)胞和HIV)，是最具吸引力和最有效的基因療法之一，但構(gòu)建新型重組HIV載體并非易事，其中最關(guān)鍵性難題是需要有非�？煽康恼{(diào)節(jié)方式來保障專一性殺滅HIV感染細(xì)胞和HIV而不損傷正常細(xì)胞。本發(fā)明利用人類的正常細(xì)胞基因組與HIV(主要指HIV-1型的野生型)基因組表達(dá)產(chǎn)物之間的差異性焦點(diǎn)，即HIV編碼基因表達(dá)關(guān)鍵性產(chǎn)物所獨(dú)有的作用機(jī)理，通過三種調(diào)節(jié)方式：①Rev蛋白調(diào)節(jié)方式。②蛋白酶調(diào)節(jié)方式。③Rev蛋白和蛋白酶雙重調(diào)節(jié)方式。解決重組HIV載體的強(qiáng)大毒性蛋白編碼基因僅在HIV感染細(xì)胞中表達(dá)，而不會有1分子毒性蛋白在正常細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的創(chuàng)新性方法，預(yù)期產(chǎn)品的獨(dú)特作用最有可能根治艾滋病毒感染與艾滋病。 |
| 國際公布 |
