| 公開(公告)號 | CN1594568A |
| 公開(公告)日 | 2005.03.16 |
| 申請(專利)號 | CN200410041075.0 |
| 申請日期 | 2004.06.24 |
| 專利名稱 | 一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體 |
| 主分類號 | C12N15/21 |
| 分類號 | C12N15/21;C12N15/10;C12N15/81;C07H21/00;C12N15/63 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 陳溥言;蔡梅紅 |
| 地址 | 210095江蘇省南京市衛(wèi)崗1號南京農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處錢寶英 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 |
| 代理人 | 樓高潮 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項 | 一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法，包括：(一)重組到畢赤酵母上的雞α干擾素的基因序列的擴(kuò)增A)引物的設(shè)計：引物1：5‘AATTCAATTCTGCAACCACCTTCGCCCC’3引物2：5‘CCGATCTAGAGTTTGGGGATTA’3B)雞全血淋巴細(xì)胞總RNA的提取取500μL培養(yǎng)以ConA刺激4～10h的雞全血分離的淋巴細(xì)胞的懸液，向其中加入800μLTripure細(xì)胞裂解液，振蕩混勻后，置于室溫下10min，然后向其中加入200μL氯仿，混勻后于室溫下靜置5min分鐘，再于12000g4℃下離心15min；吸取上清，向其中加入0.5倍體積的異丙醇，充分混勻后于室溫下靜置15min，隨后在12000g4℃下離心10min；排盡管內(nèi)液體，向管內(nèi)加入1mL70％乙醇進(jìn)行洗滌，混勻后，7500g4℃離心5min；棄去液體，待管壁稍干燥后加入20μLDEPC處理的超純水溶解，即得到雞淋巴細(xì)胞總RNA；C)含有雞α干擾素基因序列cDNA第一條鏈的合成用新鮮提取的淋巴細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RT-PCR，具體加樣如下：細(xì)胞總RNA9.2μL5×反轉(zhuǎn)錄Buffer4.0μL10mMdNTP2.0μL25mMMgCI20.8μLRnasin1.0μL引物11.0μL引物21.0μL將上述反應(yīng)混合物于掌式離心機(jī)上稍作離心，然后于在PCR儀；上65℃15min后加入反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV1.0μL，后42℃1h，94℃5min后結(jié)束反應(yīng)；D)PCR反應(yīng)體系如下：ddH2O34μL10×PCRBuffer4.0μL25mmol/LMg2+1.4μLRT產(chǎn)物10μLrTaq0.6μL總體積50μL在PCR儀上設(shè)置94℃5min，隨后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30個循環(huán)，結(jié)束循環(huán)后72℃10min；對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的雞α干擾素基因大小為488bp；(二)含有雞α干擾素成熟蛋白基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定利用通過RT-PCR擴(kuò)增的雞α干擾素成熟蛋白基因有ECORI和XbaI兩個酶切位點，把雞α干擾素成熟蛋白基因切下后與已經(jīng)同樣兩種限制性內(nèi)切酶酶切的pPICZa-A酵母載體相連，再經(jīng)ECORI和XbaI酶切，切下大小為488bp的條帶則可以鑒定為陽性；(三)感受態(tài)酵母菌的制備：挑取畢赤酵母X-33平板上的一個單菌落轉(zhuǎn)接于2mlYPD試管中，28℃250rpm恒溫?fù)u過夜活化12h后，取500ul的活化后的酵母菌液轉(zhuǎn)接于50ml的含有無菌5mlYPD培養(yǎng)基的三角瓶中，瓶口用三層滅菌紗布扎緊，28℃恒溫?fù)u床250rpm搖蕩培養(yǎng)20h左右。待菌液OD600＝1.3-1.5時，4℃1500g離心4min收獲細(xì)胞。細(xì)胞依次用1000ml冰預(yù)冷水和1000ml冰預(yù)冷的1M山梨醇洗滌，4℃1500g離心5min，最后用0.8ml冰預(yù)冷的1M山梨醇懸浮菌體，分裝不同的ep管后，置4℃待用；(四)含有雞α干擾素成熟蛋白基因的酵母表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入酵母菌 |
| 摘要 | 本發(fā)明一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體屬于用分子生物學(xué)方法獲得的基因工程生物制品。將雞α干擾素的基因序列通過電轉(zhuǎn)化方式整合到酵母上的特定位置。采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因，表達(dá)外源蛋白的純度高于70％，經(jīng)過65636倍稀釋發(fā)現(xiàn)能完全抑制100-1000TCID50的水皰性口炎病毒的攻擊。雞α干擾素對VSV和禽流感病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯階段抑制能力尤其明顯，對新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒等也都有較強(qiáng)的抑制作用，而且還有強(qiáng)大抗腫瘤、抗增殖作用，對雞的馬立克氏病毒也具有較強(qiáng)的抑制作用。 |
| 國際公布 |
