| 公開(公告)號 | CN1737162A |
| 公開(公告)日 | 2006.02.22 |
| 申請(專利)號 | CN200510038448.3 |
| 申請日期 | 2005.03.16 |
| 專利名稱 | 表皮生長因子受體(EGFR)基因測序檢測方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院);賴仁勝;謝 玲 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 賴仁勝;謝 玲;申龍樹;朱長樂 |
| 地址 | 210029江蘇省南京市漢中路155號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 南京縱橫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 |
| 代理人 | 孫永生 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 表皮生長因子受體(EGFR)基因測序檢測方法，它包括下列步驟：(1)檢測材料和對象各種途徑獲取的非小細(xì)胞癌的體細(xì)胞組織、肺癌的石蠟包埋組織的切片、肺癌晚期轉(zhuǎn)移灶組織和血液中的癌細(xì)胞、肺癌胸水和穿刺細(xì)胞或痰細(xì)胞；(2)使用試劑和儀器DNA提取的試劑盒PCR純化試劑盒ABI測序試劑盒儀器：DNA定量儀電泳儀自動凝膠顯像系統(tǒng)PCR儀冷凍離心機(jī)基因測序儀基因分析軟件(3)檢測流程首先對檢測材料進(jìn)行病理學(xué)技術(shù)制片，觀察，出具病理診斷報告；備案，判斷是否為非小細(xì)胞肺癌并病理分類，選定病灶區(qū)域后取材切片納入基因測序檢測；組織前處理及抽提DNA，每批組設(shè)立肺癌周圍組織對照；DNA定量儀檢測樣本質(zhì)量(260nm吸光率大于0.05，A260/A280比值1.6-1.8，320nm波長處吸光率接近零)；使用已設(shè)定的引物(EGFR外顯子18、19和21全長DNA序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；凝膠自顯影電泳觀察分析PCR效果；PCR產(chǎn)物純化；PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)；使用基因測序儀進(jìn)行EGFR基因的測序和分析；如陰性結(jié)果時做雙向測序檢測；依據(jù)病理診斷，臨床檢查治療情況和序列分析結(jié)果進(jìn)行綜合評估；完成EGFR病理基因測序報告；(4)觀察指標(biāo)依據(jù)美國國立醫(yī)學(xué)圖書館(www.NCBI.NLM.NIH.GOV)提供的EGFRDNA公開序列(NM-005228)和mRNA的序列，確定EGFR第18、19和21外顯子全長片斷；①EGFR第18外顯子片段長度為437bp，主要觀察核苷酸2155G＞A突變，即氨基酸G719s改變②EGFR第19外顯子片斷長度為411bp，主要觀察核苷酸2235-2249Del，即氨基酸E746-A750del缺失現(xiàn)象核苷酸2236-2250Del，即氨基酸E746-A750del缺失現(xiàn)象核苷酸2254-2277Del，即氨基酸S752-I759del缺失現(xiàn)象其它核苷酸片段缺失、插入、重復(fù)現(xiàn)象，如氨基酸L747-T75linsS，L747-P753insS和L747-A750del；③EGFR第21外顯子，片段長度為399bp，主要觀察核苷酸2576T＞G，即氨基酸L858R現(xiàn)象改變核苷酸2497T＞G(L833V)2504A＞T(H835L)核苷酸q852其它核苷酸雜合突變現(xiàn)象，如氨基酸L861Q改變；首先確定EGFR第18、19和21外顯子基因堿基序列及其突變位點(diǎn)：根據(jù)美國國立圖書館(www.NCB5.NLM.NIH.gov)公開提供的EGFR全基因序列(NM-005228)和mRNA序列，參照美國ABI公司Cerelar數(shù)據(jù)庫相關(guān)基因文獻(xiàn)和《science》2004、304(5676)：1457-1500，EpubEGFR全基因組文獻(xiàn)，本發(fā)明選定需要測序的EGFR基因外顯子如下：Exon18EGFR18外顯子序列cctgctgggccatgtctggcactgctttccagcatggtgagggctgaggtgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGTTCGGCACGGTGTATAAGgtaaggtccctggcacaggcctctgggctgggccgcagggcctctcatggtctggtggggagcccagagtccttgcaagctgtatatttccatcatctactttacExon19EGFR19外顯子序列cagttaacgtcttccttctctctctgtcatagGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTExon21EGFR21顯子序列tgtccctcacagcagggtcttctctgtttcagGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAAtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggaccaggctgccttcc對上述基因片段的觀察突變位點(diǎn)主要包括三方面：(1)已報道的突變位點(diǎn)Exon18核苷酸第2155位G＞A突變(G719S)Exon19核苷酸第2235-2249缺失(E746-A750del)核苷酸第2236-2250缺失(E746-A750del)核苷酸第2254-2277缺失(S752-I759del)核苷酸缺失(L747-T751insS)核苷酸缺失(L747-P753insS)核苷酸缺失(L747-A750del)Exon21核苷酸第2573T＞G突變(L858R)核苷酸突變(L861Q)(2)中國人的突變位點(diǎn)Exon21核苷酸第2497位T＞G(L833V)核苷酸第2504位A＞T(H835L)核苷酸第2556位插入堿基G(Q852)(3)由發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的EGFR18、19和21外顯子新突變位點(diǎn)(4)設(shè)計(jì)引物依據(jù)上述EGFR基因片段，確定了EGFR第18、19和21外顯子，利用Oligo軟件獨(dú)立設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，并參考優(yōu)化的PCR條件和測序適應(yīng)性分析，合成引物序列如下： |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種表皮生長因子受體基因檢測分析方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)社會應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明設(shè)計(jì)的EGFR第18、19和21外顯子基因片段，可以逐個從堿基和氨基酸水平與觀察分析中國人特有的該基因序列特征和突變特點(diǎn)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的第21外顯子T＞G突變和A＞T及852位密碼子始插入G突變是國內(nèi)外均未見報道的新的雜合性突變，用于鑒定中國人靶向藥物治療，具有針對性。本發(fā)明提供了一種檢測EGFR基因突變的檢測方法，檢測后再決定是否服藥，可明顯控制吉非替尼的不良副作用，減少不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，提示非小細(xì)胞肺癌分子靶向藥物治療的良好效果。 |
| 國際公布 |
