| 公開(公告)號 | CN1238522C |
| 公開(公告)日 | 2006.025 |
| 申請(專利)號 | CN02155058.1 |
| 申請日期 | 2002.12.20 |
| 專利名稱 | 白細胞介素－2及其基因在戒毒應用中的測試方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號 | C12Q1/68(2006.01)I;G01N33/68(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61K38/20(2006.01)I;A61P25/36(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 中國科學院上海生命科學研究院 |
| 發(fā)明(設計)人 | 劉新恒;顧錦法;王晉慧;姚明忠 |
| 地址 | 200031上海市岳陽路319號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 上海新天專利代理有限公司 |
| 代理人 | 王 巍 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權項 | 白細胞介素-2IL-2及其基因在戒毒應用中的測試方法，其特征在于該方法包括下列步驟：(1)真核表達質粒pcDNA3-IL-2的構建人IL-2基因經(jīng)EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接頭的全長含信號肽的人IL-2cDNA462bp克隆入經(jīng)相同酶切的pcDNA3載體Invitrogen，IL-2基因在CMV啟動子的控制下表達，構建的質粒轉化入大腸桿菌JM109擴增，堿裂解法制備質粒，聚乙二醇沉淀法純化，通過測定260nm的光吸收來確定質粒濃度，注射時質粒稀釋于含5％葡萄糖的磷酸緩沖液中；(2)重組腺病毒Ad5-IL-2的構建人IL-2基因經(jīng)EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接頭的全長含信號肽的人IL-2cDNA462bp克隆入經(jīng)相同酶切的pCA13載體Microbix，得到pCA13-IL-2，此時IL-2基因在CMV啟動子的控制下表達，pCA13-IL-2與腺病毒基因組質粒pBHG10Microbix共轉染293細胞，進行同源重組，篩選重組腺病毒，擴增純化腺病毒，注射時病毒稀釋于含5％蔗糖的PBS中；(3)嗎啡依賴小鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴小鼠模型，此組小鼠為嗎啡依賴組，嗎啡依賴小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組小鼠為嗎啡戒斷組；(4)嗎啡依賴大鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴大鼠模型，此組大鼠為嗎啡依賴組，嗎啡依賴大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組大鼠為嗎啡戒斷組；(5)IL-2蛋白及pcDNA3質粒介導IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮小鼠模型，在末次給嗎啡3小時后，將成癮的小鼠隨機分為8組，每組10只，蛋白治療組：經(jīng)第5與第6腰椎之間，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IUIL-2蛋白，對照組為含5％葡萄糖的0.01M磷酸緩沖液，IL-2基因治療組：8μgpcDNA3/8μglipofectamine，對照組，提前24小時注射，8μgpcDNA3-IL-2/8μglipofectamine，基因治療組，提前24小時注射，注射總體積為10μl，注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內小鼠的體重變化；(6)IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮大鼠模型，在末次給嗎啡3小時后，將成癮的大鼠隨機分為4組，每組5-11只，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導管鞘內，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射2×104，4×104，1.4×105IUIL-2蛋白，對照組為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl，注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動、異常姿勢、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計算戒斷癥狀總評分值；(7)腺病毒載體介導IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測試方法的建立大鼠經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導管鞘內，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型Ad5，1×107pfuAd5-IL-2，注射總體積為10μl，注射后一周測定腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內小鼠的體重變化；(8)成癮性試驗a.小鼠豎尾試驗：小鼠隨機分為六組，每組10只，分別腹腔注射嗎啡20mg.kg-1陽性對照，腹腔注射含5％葡萄糖的PB陰性對照，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU，觀察給藥后2小時內小鼠有無出現(xiàn)S形豎尾反應；b.小鼠跳躍反應試驗：小鼠隨機分為三組，每組10只，分別皮下注射含5％葡萄糖的PB陰性對照組或嗎啡陽性對照組，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次，9:00、10:00、11:00、13:00、15:00，第二天注射2次9:00、11:00，嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and6.4×105IU，于最后一次給藥后2小時，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內小鼠跳躍反應次數(shù)；(9)統(tǒng)計方法采用單因素方差分析。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬基因工程技術領域。本發(fā)明公開了一種白細胞介素-2(IL-2)及其基因在戒毒應用中的測試方法。通過本發(fā)明的方法表明蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白有較好的戒毒作用，其效果呈劑量依賴性。pcDNA3-IL-2基因也有一定的戒毒作用，通過對該基因導入條件的進一步優(yōu)化，其戒毒效果可望更好，更適合實際實用。 |
| 國際公布 |
