| 公開(公告)號(hào) | CN1810981A |
| 公開(公告)日 | 2006.08.02 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200510013153.0 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.01.28 |
| 專利名稱 | 乳腺癌轉(zhuǎn)移中參與新陳代謝作用基因的分離及分離方法 |
| 主分類號(hào) | C12P19/34(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12P19/34(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C12N5/06(2006.01)I;C07H21/04(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 南開大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 葉麗虹;張曉東;尤嘉琮;吳晶輝 |
| 地址 | 300071天津市衛(wèi)津路94號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 天津市學(xué)苑有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 |
| 代理人 | 鄭 楠 |
| 國(guó)省代碼 | 天津;12 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種乳腺癌轉(zhuǎn)移中參與新陳代謝作用基因的分離方法，其特征在于包括： 1)用SCID(Severecombinedimmunodeficiency，SCID)鼠從人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中篩選和建立具有高轉(zhuǎn)移傾向的轉(zhuǎn)移亞克隆LM-MCF-7細(xì)胞系； 2)細(xì)胞培養(yǎng) 將LM-MCF-7和MCF-7細(xì)胞用RPMI1640(含有10％FBS、100u/ml硫酸鏈霉素和100u/ml青霉素)培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 3)總RNA提取 一步法提取MCF-7和LM-MCF-7細(xì)胞的總RNA，用異丙醇沉淀，并過(guò)柱純化； 4)cDNA反轉(zhuǎn)錄及熒光標(biāo)記 取一定量總RNA，以T7-Oligo(dT)15為引物，合成雙鏈cDNA，純化；之后將雙鏈cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA、純化；取cRNA，用SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(200u/μl)，9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA并純化；取cDNA，用9個(gè)堿基的隨機(jī)序列寡核苷酸引物和KLENOW酶進(jìn)行熒光標(biāo)記，之后純化并抽干；標(biāo)記過(guò)程中dATP，dGTP，dTTP使用濃度為120μM，dCTP為60μM，Cy5-dCTP，Cy3-dCTP為40μM，dNTP為10mM； 5)制備人寡聚核苷酸標(biāo)準(zhǔn)基因芯片 將Qiagen公司人類基因的Oligo庫(kù)中的寡聚DNA點(diǎn)制在一張75×25mm、經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的載玻片上；點(diǎn)制在芯片上的樣品還包括人的12個(gè)看家基因作為陽(yáng)性對(duì)照，12條人工合成的與人基因沒(méi)有同源性的70個(gè)堿基的寡聚DNA作為陰性對(duì)照，以及擬南芥的3個(gè)基因作為外標(biāo)；整個(gè)點(diǎn)陣分成48個(gè)亞陣；每個(gè)亞陣有22行，22列；點(diǎn)間距為185μm，點(diǎn)的直徑約為140μm； 6)雜交與洗滌 將標(biāo)記的DNA溶于35μl雜交液中，放入標(biāo)準(zhǔn)基因芯片于42℃雜交過(guò)夜；雜交結(jié)束后，將芯片在42℃含有0.2％SDS和2×SSC的液體中洗5分鐘，再在0.2×SSC中室溫洗5分鐘，最后甩干用于掃描； 雜交液的組分為：3×SSC，0.2％SDS，5×Denhart’s，25％甲酰胺； 7)篩選確定 用ScanArrayExpress雙通道激光掃描儀掃描基因芯片，用GenePixPro4.0軟件分析芯片上每個(gè)點(diǎn)Cy3和Cy5熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值，并用Lowess方法歸一化；以差異為兩倍(即比值大于2.0，小于0.5)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定差異表達(dá)基因。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種高精確度、高通量篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移中參與新陳代謝作用基因的分離方法。本發(fā)明方法通過(guò)建立具有高轉(zhuǎn)移傾向的轉(zhuǎn)移亞克隆LM-MCF-7細(xì)胞系與其親本人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7形成配對(duì)細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)樣本，不僅可隨時(shí)無(wú)限量培養(yǎng)獲得，且由于實(shí)驗(yàn)樣本的細(xì)胞成分均一，保證了分離結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明方法還通過(guò)基因表達(dá)譜芯片技術(shù)分離出了這些在乳腺癌轉(zhuǎn)移中參與新陳代謝作用的基因，這些基因的表達(dá)和功能的確認(rèn)，在乳腺癌藥物或基因治療方面以及在用于制備腫瘤轉(zhuǎn)移芯片、制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移基因疫苗及建立抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選技術(shù)平臺(tái)方面，都將有著重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 |
| 國(guó)際公布 |
