| 公開(公告)號(hào) | CN1268643C |
| 公開(公告)日 | 2006.08.09 |
| 申請(專利)號(hào) | CN200310113791.0 |
| 申請日期 | 2003.11.25 |
| 專利名稱 | 一種抗SARS-CoV IgY抗體及其制備方法 |
| 主分類號(hào) | C07K16/18(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C07K16/18(2006.01)I;C07K16/02(2006.01)I;A61K39/395(2006.01)I;A61K9/19(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I;A61P11/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 王希良;杜新安;石辛甫;張松樂;趙光宇;田 光;劉士山;朱和平;周 華 |
| 地址 | 100071北京市豐臺(tái)區(qū)東大街20號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 北京太兆天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 張 韜 |
| 國省代碼 | 北京;11 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種特異性雞抗SARS-CoV的IgY抗體，其特征在于該抗體是由如下方法制備的： 1)純化的滅活SARS-CoV抗原與等量不完全福氏佐劑乳化制備免疫原，經(jīng)胸肌及大腿內(nèi)側(cè)肌肉免疫檢疫的育齡來亨雞母雞，間隔10天免疫一次，共免疫3次，免疫前后當(dāng)提純的雞蛋黃抗體對(duì)流電泳效價(jià)達(dá)1∶64、間接ELISA抗體效價(jià)達(dá)1∶6400以上收集雞蛋； 2)生產(chǎn)抗SARS-CoVIgY抗體的雞，每間隔一個(gè)月再用純化滅活SARS-CoV抗原與福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，收集抗體雞蛋； 3)棄蛋殼、蛋清及卵黃膜，取出卵黃與蒸餾水按1∶8稀釋，充分混勻后4℃過夜，取上清液離心，再棄沉淀及上層脂質(zhì)，取中層清液加入19％固體硫酸鈉，45℃水浴，充分溶解再離心；沉淀溶于適量蒸餾水，6萬超濾柱超濾除鹽、濃縮和去雜蛋白，濾液為純化的雞抗SARS-CoVIgY抗體，制備噴霧劑型及凍干制品； 其中步驟1)中所用純化的滅活SARS-CoV抗原按如下步驟制備： A、綠猴腎細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)，取細(xì)胞種子庫凍存Vero細(xì)胞株，用DMEM培養(yǎng)基并加入10％小牛血清培養(yǎng)，提供培養(yǎng)SARS-CoV的Vero細(xì)胞； B、SARS冠狀病毒滴定，對(duì)培養(yǎng)的Vero細(xì)胞加入經(jīng)鑒定凍存的SARS-CoV，擴(kuò)增培養(yǎng)SARS-CoV，采用組織培養(yǎng)半數(shù)感染量測定SARS-CoV的毒力106-108，對(duì)滴定的SARS-CoV分裝凍存； C、SARS-CoV感染Vero細(xì)胞生產(chǎn)SARS-CoV，用長滿單層的Vero細(xì)胞加入滴定的SARS-CoV，用無血清DMEM培養(yǎng)SARS-CoV； D、Vero細(xì)胞完全病變后收集SARS-CoV培養(yǎng)液，反復(fù)凍融三次，冰凍-37℃或不凍融，收集SARS-CoV細(xì)胞培養(yǎng)液； E、向SARS-CoV培養(yǎng)液加入1/2000-1/8000的β-丙內(nèi)酯，4℃過夜、37℃2h滅活SARS-CoV，取滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液在Vero細(xì)胞上連傳三代，檢測SARS-CoV滅活效果； F、滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液，4℃、離心12000rpm/min30min，棄沉淀雜蛋白，上清為SARS-CoV液； G、用分子量30萬超濾柱超濾SARS-CoV液，濃縮和去雜蛋白，濾液為粗制滅活SARS-CoV； H、對(duì)粗制滅活SARS-CoV上SepharoseCL-2B分子篩純化，對(duì)粗制滅活SARS-CoV上SepharoseCL-2B柱層析，0.01Mtris-HClPH7.4緩沖液洗脫，收集SARS-CoV，合并濃縮收集初步純化SARS-CoV； I、對(duì)初步純化的SARS-CoV液上DE52陰離子柱層析純化，用0.03MNacl、50mMTrisPH8.0緩沖液洗脫，收集SARS-CoV峰，合并濃縮收集純化SARS-CoV； J、對(duì)超濾濃縮后SARS-CoV液的效果分析，用雙抗體夾心法測得抗原回收率平均為55％、用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為92％； K、對(duì)凝膠過濾純化SARS-CoV的效果分析，用雙抗體夾心法測得抗原回收率平均為85％、采用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為94.5％、用電鏡觀察病毒顆粒完整、用斑點(diǎn)雜交測定Vero細(xì)胞殘留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制實(shí)驗(yàn)測定病毒殘余牛血清含量小于12.5ng/ml； L、對(duì)離子交換純化SARS-CoV的效果分析，用雙抗體夾心法測得蛋白抗原由純化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC顯示病毒純度為97％；采用改良Lowry法測得雜蛋白去除率平均為98.5％；用電鏡觀察病毒顆粒完整、用斑點(diǎn)雜交測定Vero細(xì)胞殘留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE顯示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白條帶，并與恢復(fù)期SARS病人的血清發(fā)生反應(yīng)，純化滅活SARS-CoV分裝放-70℃保存。 |
| 摘要 | 本發(fā)明的公開一種新型的用于治療、預(yù)防SARS-CoV的雞抗SARS-CoV IgY抗體蛋，同是本發(fā)明公開一種新型的用于治療、預(yù)防診斷SARS-CoV的雞抗SARS-CoV IgY抗體。本發(fā)明抗體能特異消滅SARS-CoV，對(duì)非典型肺炎的治療和預(yù)防有很好的效果。 |
| 國際公布 |
