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1.2 細(xì)胞株
HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)由華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院王澤華教授惠贈(zèng)。
1.3 細(xì)胞培養(yǎng)
培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。DMEM培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞待用。
1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)
采用噻唑藍(lán)(MTT)還原法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,96孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞,每孔加含4 000個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基200 μL,培養(yǎng)24 h后,吸盡培養(yǎng)基，以無(wú)血清培養(yǎng)基加TCS,使終濃度分別為10、20、40、80、160 mg/L。以有細(xì)胞不含藥物的培養(yǎng)基為對(duì)照組，以無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)濃度及對(duì)照均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48和72 h后,加MTT,在37 ℃培養(yǎng)4 h后，吸出上清液，每孔加150 μL DMSO,將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處光密度值(OD值)。將各測(cè)試孔的OD值減去本底(空白對(duì)照組)OD值，各復(fù)孔的OD值取(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)。按公式細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
1.5 細(xì)胞周期觀察及凋亡檢測(cè)
取不同濃度TCS(20、40和80 mg/L)分別作用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞48 h后,收集細(xì)胞，按凱基PI染料試劑盒操作說(shuō)明收集處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,采用Modfit分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期DNA含量分析及細(xì)胞凋亡率檢測(cè)。
1.6 組織基因組DNA提取和DNA亞硫酸氫鹽處理
按照組織基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明提取HeLa細(xì)胞的基因組DNA，甲基化試劑盒的說(shuō)明行DNA變性和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，修飾后的DNA-20 ℃保存待用。
1.7 MSP(甲基化特異性PCR,methylation-specific PCR)
APC基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)采用MSP法，當(dāng)APC基因啟動(dòng)子甲基化則甲基化引物有PCR產(chǎn)物;反之，則非甲基化引物有PCR產(chǎn)物。APC基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化引物：上游引物：5′-GGTATATTTTCGAGGGGTACG-3′，下游引物：5′-TTCCCGACCCGCACTCCGC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度90 bp;非甲基化引物：上游引物：5′-TGTGAGGGTATATTTTTGAGGGGTAT-3′，下游引物5′-CTTCTCTCTCCACTTCCCAACCCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度109 bp[2]。每50 μL PCR反應(yīng)體系包括：50 ng修飾后的DNA，5×PCR緩沖液10 μL，上下游引物各20 pmol， Taq DNA聚合酶1.25 u，10 mM dNTP Mix1 μL。PCR條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性60 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,循環(huán)38次,72 ℃再延伸4 min。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察并成像。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
計(jì)量資料用x±s表示,采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件。藥物濃度與抑制率關(guān)系用線性回歸分析，方差分析檢驗(yàn)。細(xì)胞周期與凋亡率組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD和SNK檢驗(yàn)(方差齊)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。
2 結(jié)果
2.1 TCS對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
TCS對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用(見(jiàn)表1)。同一時(shí)間下，隨著TCS濃度增大，抑制率顯著增大(P<0.01)。采用線性相關(guān)分析同一時(shí)間下濃度與抑制率的相關(guān)性，24 h回歸方程為Y=0.187+0.002X[Y為抑制率，X為T(mén)CS濃度(單位mg/L)]，決定系數(shù)R2 =0.965，P=0.003。48 h回歸方程為Y=0.331+0.002X，R2 =0.945，P=0.006。72 h回歸方程Y=0.378+0.003X，R2=0.965，P=0.002。
表1 不同濃度TCS對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制率(略)
2.2 TCS對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響
分析TCS作用HeLa細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期的變化(見(jiàn)表2)，HeLa細(xì)胞在20 mg/L TCS作用后G1/G0期細(xì)胞百分比與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05),40 mg/L、80 mg/L組與對(duì)照組比較降低(P<0.01)，三種濃度間比較有顯著差異(P<0.01)。三種濃度S期細(xì)胞百分比較對(duì)照組增高(P<0.01),三種濃度間比較有顯著差異(P<0.01)。三種濃度G2/M期細(xì)胞百分比較對(duì)照組均降低(20 mg/L，P<0.05;40 mg/L、80 mg/L，P<0.01)，三種濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.3 TCS對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率的影響
分析TCS作用HeLa細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率的變化(見(jiàn)表2)，三種TCS濃度作用后分別與對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.01)。三種濃度之間比較亦有顯著差異(P<0.01)。
2.4 TCS對(duì)HeLa細(xì)胞APC基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)影響
TCS處理前HeLa細(xì)胞APC基因啟動(dòng)子甲基化和非甲基化產(chǎn)物均為陽(yáng)性,見(jiàn)圖1。20、40 mg/L TCS處理細(xì)胞48 h，APC基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)未改變。80 mg/L TCS處理HeLa細(xì)胞48 h后，APC基因非甲基化產(chǎn)物有PCR擴(kuò)增條帶，而APC基因甲基化產(chǎn)物無(wú)擴(kuò)增條帶。
表2 不同濃度TCS對(duì)HeLa細(xì)胞周期及凋亡率的影響(n=3)(略)
注：與對(duì)照組比較,^P<0.05，△P<0.01。
圖1 TCS處理前后HeLa細(xì)胞APC基因甲基化狀態(tài)(略)
