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醫(yī)學(xué)論文范文:一氧化氮合酶在犬下頜骨牽張成骨過程中的表達(dá)和意義
【摘要】 目的 研究一氧化氮合酶(NOS)在犬下頜骨牽張成骨及骨創(chuàng)傷修復(fù)過程的表達(dá)和意義。方法 28只犬隨機分成牽張組和直接延長組各12只及正常對照組4只，用免疫組化法檢測牽張第6天、牽張后固定2周和8周NOS表達(dá)水平的變化。結(jié)果 牽張第6天牽張組可見牽開區(qū)組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，血管周圍和間質(zhì)內(nèi)較多紅細(xì)胞漏出。牽張及固定早期，牽張組和直接延長組誘導(dǎo)型NOS(iNOS)與內(nèi)皮型NOS(eNOS)陽性表達(dá)均明顯高于正常對照組，直接延長組的iNOS和eNOS陽性表達(dá)低于牽張組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);牽張后固定8周iNOS和eNOS陽性表達(dá)3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 NOS在牽張早期表達(dá)升高，結(jié)合在牽張早期組織內(nèi)紅細(xì)胞漏出，提示牽張成骨過程中存在某種程度的微創(chuàng)傷，這種微創(chuàng)傷可能是牽張成骨的重要啟動因素之一。
【關(guān)鍵詞】 牽張成骨; 一氧化氮合酶; 創(chuàng)傷
Expression and significance of nitric oxide synthase in mandibular distraction osteogenesis of canine ZHOU Nuo, LIAO Ni, WEI Shan-liang, LIANG Fei-xin. (Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)
[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of nitric oxide synthase(NOS) during mandibulardistraction osteogenesis and bone trauma healing, to futher study the mechanism of distraction osteogenesis. Methods Twenty-eight adult dogs were randomly divided into DO group(12 dogs), acutely lengthening group(12 dogs) andcontrol group(4 dogs). Immunohistochemical examination were carried out to test the expression of NOS during the sixthday in distraction period, the second and eighth week of consolidation. Results In DO group infiltration of inflammatory cell was found in the distraction gap, more red blood cells(RBC) leak out around vascellum and matrix in the sixth dayin distraction period. The expression of local iNOS(inducible NOS) and eNOS(endothelinal NOS) in DO gruoup andacutely lengthening group was higher than that in the control group(P<0.05), the expression of local iNOS and eNOSin acutely lengthening group was lower than that in DO group(P<0.05) in the early of distraction period and the consolida-tion. The expression of local iNOS and eNOS was no statistic difference between three groups(P>0.05) in the eighthweek of consolidation. Conclusion NOS as a sensitive index of tissue trauma are highly expressed, and RBC wasfound leaking out in the early of distraction, indicating that micro-trauma to some extent may occurr during DO pro-cedure, the micro-trauma may be one of the significant factors which increasing regeneration of bone during DO.
[Key words] distraction osteogenesis; nitric oxide synthase; trauma
牽張成骨術(shù)(distraction osteogenesis，DO)是利用骨創(chuàng)傷愈合機制產(chǎn)生新骨的一項內(nèi)源性組織工程技術(shù)[1]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為DO的過程，是經(jīng)過一系列復(fù)雜的細(xì)胞和分子生物學(xué)行為完成的，然而，組織細(xì)胞將受到的機械應(yīng)力刺激轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)生化信號的機制，目前尚未完全明確。本課題組在前期實驗[2-3]中發(fā)現(xiàn)，在牽張前期，無論是牽張組還是直接延長組多種細(xì)胞生長因子的表達(dá)均明顯升高，這一現(xiàn)象與骨折修復(fù)早期其他文獻(xiàn)報道相似[4-5]，因此推測創(chuàng)傷極有可能是牽張成骨重要的啟動因素之一。本研究利用早期已經(jīng)建立的犬雙側(cè)下頜骨牽張成骨動物模型，采用免疫組化法檢測損傷敏感指標(biāo)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)在牽張成骨及骨創(chuàng)傷修復(fù)過程中的表達(dá)和變化規(guī)律醫(yī).學(xué)全.在.線gydjdsj.org.cn。
1 材料和方法
1.1 主要材料
廣西區(qū)實驗動物中心提供的健康雜種犬28只，雌雄不限，年齡1.5～2歲，體重10～15 kg。自制牽張器，DMR+Q550型病理圖像分析系統(tǒng)(Leica公司，德國)，BX40顯微鏡(Olympus公司，日本)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide syn-thase，eNOS)多克隆犬抗、即用型Ultra SensitiveTMS-P試劑盒等(均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組 將28只犬隨機分成3組：牽張組12只，直接延長組12只，正常對照組4只。
1.2.2 手術(shù)方法 參照參考文獻(xiàn)[6]。
1.2.3 標(biāo)本獲取與處理 所有動物處死后取牙槽嵴下部分骨組織標(biāo)本用10%中性甲醛固定24 h后，置于10%的EDTA脫鈣液進(jìn)行脫鈣，乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切成3～5 μm厚的連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅染色。
1.2.4 免疫組化染色及結(jié)果分析 將上述切片用免疫組化SP法檢測雙下頜牽張區(qū)新生組織中iNOS和eNOS的含量。多克隆抗體工作濃度為1∶100，按說明書要求進(jìn)行免疫組化染色，用公司提供的陽性片作陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。在光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化結(jié)果，以組織內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒代表NOS的陽性信號。采用Leica DMR+Q550型病理圖像分析儀對染色陽性強度進(jìn)行灰度分析，灰度值：0(黑)~255(白)，染色越深，灰度值越低。
1.3 統(tǒng)計分析
用SPSS 13.0統(tǒng)計分析系統(tǒng)進(jìn)行t檢驗和方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 一般情況
實驗犬在實驗過程中全部存活，傷口無感染(圖1)，牽張器固定牢固，無斷裂和變形，牽張區(qū)域無紅腫、滲出、破潰，產(chǎn)生并維持了所需的牽張距離(圖2)。
2.2 組織學(xué)觀察
牽張第6天牽張組牽開區(qū)細(xì)胞水腫變形，細(xì)胞間隙增寬，大量毛細(xì)血管增生，擴張充血，血管周圍和間質(zhì)內(nèi)較多紅細(xì)胞及血小板漏出，伴炎性細(xì)胞浸潤(圖3、4)，牽張間隙中可見成纖維細(xì)胞及膠原纖維出現(xiàn)沿牽引方向排列的趨勢;直接延長組拉開間隙內(nèi)為肉芽組織所充滿，大量炎性細(xì)胞浸潤，僅見少量毛細(xì)血管增生，兩側(cè)骨斷端也可見少量新生骨小梁，但排列紊亂。牽張固定期，骨小梁逐漸成熟，牽張組2側(cè)骨斷端及骨膜下可見大量沿牽張方向排列的新生骨小梁，直接延長組拉開區(qū)可見局灶性新生軟骨和少量編織骨形成，但中間仍由大量纖維結(jié)締組織連接。
2.3 免疫組化觀察
2.3.1 iNOS的表達(dá) 牽張第6天iNOS表達(dá)見圖5、6。圖 5 牽張第6天，牽張區(qū)邊緣活躍的間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞可見iNOS強陽性染色 SP × 400
圖 6 牽張第6天，直接延長組骨斷端附近的成骨細(xì)胞和少量血管內(nèi)皮細(xì)胞iNOS陽性染色 SP × 400牽張組在新生骨小梁邊緣的間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞中有強陽性染色，定位于細(xì)胞質(zhì)和少量細(xì)胞核;直接延長組在拉開間隙內(nèi)的成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和少量血管內(nèi)皮細(xì)胞有陽性染色。牽張組iNOS的平均灰度值低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，直接延長組iNOS平均灰度值低于正常對照組，但高于牽張組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);牽張后固定2周，牽張組和直接延長組iNOS的平均灰度值均升高，但仍低于正常對照組(P<0.05)，牽張組的平均灰度值低于直接延長組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);牽張后固定8周iNOS的平均灰度值逐漸升高，3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。
2.3.2 eNOS的表達(dá) 牽張第6天，牽張組在骨斷端骨小梁邊緣的血管內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞以及少量的成骨細(xì)胞中有eNOS陽性染色，著色定位于細(xì)胞質(zhì);直接延長組拉開間隙內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞出現(xiàn)eNOS陽性染色。牽張組與直接延長組eNOS的平均灰度值均低于正常對照組(P<0.05)，且牽張組的平均灰度值低于直接延長組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);牽張后固定2周牽張組eNOS的平均灰度值明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且牽張組eNOS平均灰度值低于直接延長組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖7，8);牽張后固定8周eNOS的平均灰度值逐漸升高，3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。圖 7 牽張后固定2周，牽張區(qū)邊緣的血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞有eNOS強陽性染色
3 討論
目前多數(shù)研究認(rèn)為牽張產(chǎn)生的張應(yīng)力是促進(jìn)新骨形成的主要因素。Ilizarov[7]稱骨的形狀和大小受局部骨的血供和張應(yīng)力的影響，血供增加，張應(yīng)力增加致骨量增加。近年來的分子生物學(xué)研究提示某些生長和分化因子的級聯(lián)反應(yīng)參與了促進(jìn)骨形成和血管形成的作用。然而，目前仍不知道在牽張過程中產(chǎn)生的機械應(yīng)力是如何激活機體產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)信號，牽張成骨的生物學(xué)機制尚未完全明了。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在DO和骨缺損修復(fù)早期，參與組織再生的多種細(xì)胞生長因子的表達(dá)普遍升高，這與多數(shù)學(xué)者關(guān)于骨折修復(fù)早期的研究結(jié)果相似[4-5]，他們認(rèn)為：骨折、骨截開術(shù)等可導(dǎo)致骨基質(zhì)中多種生長因子被激活，并從骨基質(zhì)中溶解釋放出來。同樣，在DO早期，多種細(xì)胞生長因子及細(xì)胞外膠原基質(zhì)明顯升高，表明DO與骨折在骨組織修復(fù)再生過程中可能具有相同的細(xì)胞分子生物學(xué)基礎(chǔ)，創(chuàng)傷極有可能是牽張成骨重要的啟動因素之一。許多研究發(fā)現(xiàn)NO和NOS與創(chuàng)傷密切相關(guān)，可作為組織損傷早期的敏感指標(biāo)之一。NO是左旋精氨酸與氧分子在NOS催化作用下的產(chǎn)物，是細(xì)胞內(nèi)外的重要生物信使分子，參與多種生理病理過程。NOS是體內(nèi)合成NO的關(guān)鍵酶，在生理狀況下處于低水平表達(dá)，在創(chuàng)傷或其他誘導(dǎo)劑的作用下，可被誘導(dǎo)生成這類酶，并持續(xù)合成NO[8]。Zhu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，鼠骨折4 d后3種NOS mRNA表達(dá)均明顯增加。張明等[10]用撞擊機撞擊兔建立頜面部創(chuàng)傷動物模型，檢測傷區(qū)NO含量，結(jié)果顯示傷后6 h傷區(qū)局部NO含量顯著升高，說明NO的生成與組織損傷程度一致。關(guān)于NO和NOS在牽張成骨中的研究，目前國內(nèi)外報道甚少。國外學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)牽張成骨過程中新骨形成與三叉神經(jīng)NOS的表達(dá)呈顯著相關(guān)關(guān)系，提示NOS可能通過神經(jīng)性途徑在骨愈合過程中起到重要的作用。張志純等[12]利用種植型牽張器增高下頜牙槽嵴，觀察成骨過程中NOS的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)iNOS和eNOS在DO過程的不同時期具有不同的表達(dá)，提示可能對DO的新骨形成起到一定的調(diào)節(jié)作用。
本研究結(jié)果顯示，牽張早期牽張組牽開區(qū)iNOS與eNOS的表達(dá)顯著高于正常對照組，且明顯高于直接延長組，牽張固定早期2實驗組iNOS與eNOS的表達(dá)逐漸下降，而牽張組iNOS與eNOS的表達(dá)仍明顯高于直接延長組。筆者認(rèn)為，NOS作為組織損傷早期的敏感標(biāo)志，2實驗組在截骨術(shù)后早期NOS表達(dá)的升高極有可能是骨組織創(chuàng)傷的一種表現(xiàn)，結(jié)合組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)牽張第6天牽張組牽開區(qū)細(xì)胞水腫變形，細(xì)胞間隙增寬，大量毛細(xì)血管增生，擴張充血，血管周圍和間質(zhì)內(nèi)較多紅細(xì)胞和血小板漏出，伴炎性細(xì)胞浸潤，更進(jìn)一步表明牽張區(qū)組織存在微創(chuàng)傷現(xiàn)象。這種微創(chuàng)傷是在牽張過程中產(chǎn)生的，在一定速率和頻率的機械牽張力的作用下，愈合過程中的纖維性骨痂發(fā)生一定程度的多次微小創(chuàng)傷，導(dǎo)致NOS及其他各種具有促進(jìn)成骨作用的生物活性物質(zhì)的釋放不斷累加升高，并維持一定濃度，持續(xù)調(diào)控新骨形成;而直接延長組的生物活性物質(zhì)只在早期有一過性高表達(dá)，表現(xiàn)為一過性的調(diào)控新骨形成。所以，直接延長組除在早期有新骨形成外，其后則無新骨形成，而以纖維瘢痕組織取而代之。筆者認(rèn)為，DO所產(chǎn)生的微創(chuàng)傷可能通過以下幾個機制對牽張成骨發(fā)生作用：1)牽張創(chuàng)傷使細(xì)胞膜發(fā)生機械形變，改變離子通透性，激活細(xì)胞間的第二信使，引起離子和分子的跨膜轉(zhuǎn)運改變，通過細(xì)胞的上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的激活而誘發(fā)體內(nèi)瀑布式激酶激活反應(yīng)。2)牽張創(chuàng)傷所致的組織損傷使得血管破壞，血液成分進(jìn)入組織間隙，炎癥細(xì)胞浸潤，啟動細(xì)胞水平的鏈?zhǔn)诫A梯反應(yīng)，分泌多種生物活性物質(zhì)，如蛋白水解酶、酶抑制劑、胞外基質(zhì)蛋白、化學(xué)誘導(dǎo)劑或生長因子，它們影響著間充質(zhì)細(xì)胞的合成、分化、增殖能力和這些細(xì)胞在血管生成及新骨形成的作用。3)牽張創(chuàng)傷導(dǎo)致局部進(jìn)行性缺血、缺氧、能量代謝障礙等，結(jié)果導(dǎo)致氧耗增加，出現(xiàn)局部低氧環(huán)境，低氧張力強烈誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)形成大量的新生血管。4)牽張創(chuàng)傷可能引起全身反應(yīng)，刺激內(nèi)分泌活動，促進(jìn)生長激素和其他生長因子的釋放，進(jìn)一步促進(jìn)成骨。因此，牽張成骨是通過一系列復(fù)雜的細(xì)胞和分子生物學(xué)行為實現(xiàn)的內(nèi)源性骨組織工程，而DO的這一細(xì)胞和分子生物學(xué)行為也許并非單純機械牽張力直接作用的結(jié)果，牽張造成的微創(chuàng)傷有可能是DO重要的啟動因素之一，是機械牽張力與各種具有促進(jìn)成骨作用的生物活性物質(zhì)釋放的重要中介。當(dāng)然，這種微創(chuàng)傷是有一定生理限度的，必須在機體所能承受并能誘發(fā)機體產(chǎn)生修復(fù)反應(yīng)的極限之內(nèi)，超過這一極限，可能造成機體不可修復(fù)的創(chuàng)傷，導(dǎo)致骨不連或延遲愈合。這也進(jìn)一步證實了眾多學(xué)者所認(rèn)可的每天1 mm的牽張速率是較為安全和理想的牽張速率[13-14]，而直接延長組將下頜骨截斷后直接拉開1 cm，所形成的創(chuàng)傷超出了機體的生理限度和成骨反應(yīng)能力，導(dǎo)致成骨不良。
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