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醫(yī)學(xué)論文范文:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)異體外周血T淋巴細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制
【摘要】 目的： 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)體外對(duì)異體外周血T淋巴細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制. 方法： 從骨髓中分離培養(yǎng)MSCs，反復(fù)貼壁進(jìn)行純化；用尼龍棉柱法純化異體外周血T淋巴細(xì)胞；觀察MSCs對(duì)植物血凝素（PHA)刺激下T淋巴細(xì)胞增殖的影響，用ELISA方法檢測(cè)IFNγ，IL4水平變化. 結(jié)果： MSCs對(duì)PHA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用，并呈劑量依賴性；同時(shí)MSCs亦可抑制T淋巴細(xì)胞的IFNγ分泌，但可促進(jìn)IL4的分泌. 結(jié)論： MSCs對(duì)異體外周血T淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用，其作用可能與其影響T淋巴細(xì)胞分泌IFNγ和IL4有關(guān).
【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)；干擾素γ；白細(xì)胞介素4
0引言
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中不同于造血干細(xì)胞的另一類成體干細(xì)胞，這類細(xì)胞易于采集、分離和體外擴(kuò)增，除具有高度增殖及多向分化潛能、促進(jìn)機(jī)體造血重建外，還具有抑制同種異體免疫反應(yīng)、減輕移植排斥等免疫調(diào)節(jié)作用，但具體機(jī)制還不清楚. 為進(jìn)一步探討MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能，我們研究了MSCs對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖及其分泌IFNγ與IL4的影響.
1材料和方法
1.1骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定抽取肝素抗凝的健康供者骨髓20 mL（n=10)，DMEM（Gibco)倍比稀釋，F(xiàn)icoll分離液（天津?yàn)?2000 r/min,15 min條件下分離出單個(gè)核細(xì)胞，DMEM洗滌2次，完全培養(yǎng)基（100 g/L胎牛血清+ DMEM)重懸細(xì)胞，以2×109/L接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃，50 mL/L CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h首次換液，以后每2～3 d換液1次，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)消化傳代培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)傳至3代MSCs的純度醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn.
1.2外周血T淋巴細(xì)胞的分離與純度鑒定取新鮮肝素抗凝人外周血20 mL，F(xiàn)icoll分離液（2000 r/min,15 min)分離出單個(gè)核細(xì)胞，尼龍棉柱法進(jìn)一步分選T淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析尼龍棉柱分離前后T淋巴細(xì)胞的純度.
1.3MSCs對(duì)植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA)作用下的T淋巴細(xì)胞增殖的影響取第3代培養(yǎng)的MSCs，經(jīng)60Co照射30 Gy，調(diào)整細(xì)胞密度，按細(xì)胞數(shù)分為3組，A組1×103個(gè)，B組1×104個(gè)，C組1×105個(gè)，每組設(shè)單獨(dú)同等數(shù)量MSCs為空白對(duì)照，以單獨(dú)T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)為陽(yáng)性對(duì)照. 以終體積100 μL／孔，加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，MSCs完全貼壁后吸去上清或更換培養(yǎng)液，并除空白對(duì)照外各組加入T淋巴細(xì)胞1×104/孔. 經(jīng)PHA 5 μg（Sigma)作用68 h后加入20 μL／孔MTT（Sigma)繼續(xù)孵育4 h，棄上清后二甲基亞砜固定，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定A值，增殖百分率=（實(shí)驗(yàn)組A值-對(duì)照組A值)/實(shí)驗(yàn)組A值.
1.4MSCs對(duì)PHA刺激下的T淋巴細(xì)胞IFNγ，IL4分泌的影響分別用1×107/L，1×108/L MSCs與1×109/L的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入5 μg 的PHA. 應(yīng)用IFNγ，IL4試劑盒（武漢博士德)檢測(cè)各組培養(yǎng)上清中IFNγ和IL4濃度.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.
2結(jié)果
2.1MSCs與T淋巴細(xì)胞純度鑒定原代MSCs形態(tài)均勻一致，呈長(zhǎng)梭形，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：傳至3代MSCs高表達(dá)CD29，CD44和CD13，而CD34，CD45，HLADR低或極低表達(dá)，純度達(dá)90%以上；異體外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)尼龍棉柱分離后CD3+細(xì)胞百分比達(dá)98%以上.
2.2MSCs抑制T淋巴細(xì)胞的增殖MSCs對(duì)PHA刺激下的T淋巴細(xì)胞增殖呈抑制效應(yīng)，并呈劑量依賴性. 單純RPMI1640培養(yǎng)基條件下，T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組的增殖率為（77.05±1.94)%，A，B，C組依次為（44.94±5.84)%，（33.45±7.00)%，（17.64±4.59)%，與陽(yáng)性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05).
2.3MSCs抑制T淋巴細(xì)胞IFNγ的分泌在單純培養(yǎng)條件下，T淋巴細(xì)胞在PHA刺激下其上清分泌IFNγ為（79.16±13.40)ng/L，與1×107/L，1×108/L的MSCs共培養(yǎng)時(shí)IFNγ的分泌分別為（25.54±7.05)，（9.55±3.60)ng/L，IFNγ分泌明顯減少（P<0.05).
2.4MSCs促進(jìn)T淋巴細(xì)胞IL4的分泌在單純培養(yǎng)條件下，T淋巴細(xì)胞在PHA刺激下其上清分泌IL4的量為（46.04±9.67)ng/L，加入1×107/L，1×108/L MSCs后，IL4的分泌增加，分別為（67.10±11.44)，（97.92±19.48)ng/L，與單純T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05).
