教案首頁
第4次課 授課時間：2006年 月 日
課程名稱 | 年級 | 05級 | 專業(yè)、層次 | 臨床醫(yī)學等各專業(yè)本科 | ||||
授課教師 | 鄔于川 | 職稱 | 副教授 | 課型（大、小) | 小 | 學時 | 3 | |
授課題目 | 對流免疫電泳、動物過敏實驗 | |||||||
基本教材及主要參考書 | 醫(yī)學免疫學實驗指導 鄔于川主編 瀘州醫(yī)學院印刷廠2002 P18~19,P50 現(xiàn)代免疫學實驗技術(shù) 沈關(guān)心、周汝麟主編 湖北科學技術(shù)出版社 1998 | |||||||
目的與要求： 掌握對流免疫電泳實驗的原理、方法及結(jié)果分析； 掌握動物過敏實驗的原理及結(jié)果分析； 熟悉試管凝集試驗的結(jié)果判定方法及意義。 實施可溶性抗原的檢測 | ||||||||
教學內(nèi)容與時間安排： 觀察上次試管凝集試驗結(jié)果---10min 自作對流免疫電泳實驗- --50min 動物過敏實驗示教--- 20min 實施可溶性抗原檢測 40min 教學方法：講授、板書、示教 | ||||||||
教學重點及如何突出重點、難點及如何突破難點： 教學重點 對流免疫電泳實驗原理及結(jié)果分析 動物過敏實驗的原理及結(jié)果分gydjdsj.org.cn/job/析 教學難點 對流免疫電泳實驗原理及結(jié)果分析 提示：將原理與實驗中的具體結(jié)果結(jié)合起來分析。 | ||||||||
教研室審閱意見： 教研室主任簽名： 年 月 日 | ||||||||
基本內(nèi)容 | 教學手段 | 課堂設(shè)計和時間安排 |
教學進程 一 觀察上次試管凝集試驗結(jié)果 【結(jié)果】 ⒈ 凝集強弱，以下列記號表示： ＋＋＋＋：管內(nèi)液體澄清，細菌全部凝集于管底，輕搖有大片凝集塊。 ＋＋＋：管內(nèi)液體輕度混濁，細菌大部分凝集于管底，凝集塊較小。 ＋＋：管內(nèi)液體中度混濁，細菌部分凝集于管底，凝集塊更細小。 ＋：管內(nèi)液體中度混濁，僅少量細菌凝集。 －：液體混濁，無凝集。若放置較長時間觀察結(jié)果，未凝集的，細菌亦可沉積于管底。與凝集塊沉淀物不同：前者是個小圓點，邊緣光滑整齊，而后者似傘狀，鋪開沉淀于管底，邊緣不整齊。 ⒉ 首先觀察第8管（對照管)。正確結(jié)果應(yīng)是管底沉淀物為圓形，邊緣整齊，輕輕振搖，細菌分散呈均勻混濁。若出現(xiàn)了非特異的凝集，則本試驗無效。 ⒊ 試驗管應(yīng)由第1管看起。H菌液凝集物呈疏松棉絮狀，沉于管底，輕搖時易離散和升起。 ⒋ 凝集效價的判定：與相應(yīng)菌液發(fā)生中等程度（＋＋)凝集的血清最高稀釋度為該被檢血清的凝集效價，用稀釋倍數(shù)表示之。如第1管仍無凝集現(xiàn)象，應(yīng)報“＜1∶40”，如第7管仍是“＋＋”或更強凝集，應(yīng)報“＞1∶2560”。 【注意事項】 ⒈ 抗原、抗體在比例適當時，才能出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)。如果抗體的濃度過高，則無凝集物形成，此為前帶現(xiàn)象，需要在測定結(jié)果時加以鑒別。 ⒉ 判定醫(yī).學全在線gydjdsj.org.cn結(jié)果時，應(yīng)在暗背景下通過強光檢查。 ⒊ 注意溫度、PH、電解質(zhì)、振搖對本試驗的影響。 ⒋ 觀察結(jié)果時，最好不要振搖試管，以免將凝集物搖散而影響他人觀察。 二 對流免疫電泳試驗 【原理】 對流免疫電泳是將雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。將瓊脂板置于電場中，在pH8.6的緩沖液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原帶負電荷向正極移動，而抗體為球蛋白，由于暴露的極性基團少，所帶負電荷低，且分子量較大，移動緩慢，同時受電滲作用的影響向負極移動（電滲是指在電場中液體對于一個固定固體的相對移動。瓊脂是一種酸性物質(zhì)，在堿性溶液中帶負電荷，而與它接觸的液體帶正電荷，因此液體向負極移動，產(chǎn)生電滲)。這樣抗原抗體相向運動，在比例適當處形成乳白色沉淀線。由于電場的作用，限制了抗原、抗體的自由擴散，而使其定向移動，因而增加了試驗的靈敏度，并縮短了反應(yīng)時間。此試驗常用于檢測甲胎蛋白（AFP)、乙肝病毒表面抗原（HBSAg)。 【材料】 1．HBSAg陽性血清、待檢血清、抗HBSAg血清。 2．用打孔器按模型打成雙排孔，孔徑3mm，孔間距4mm，行間距4mm。 3．加樣：用毛細吸管在雙排孔的一側(cè)加入抗HBSAg血清，另一側(cè)分別加入HBSAg陽性血清和待檢血清，注意抗原抗體的位置要一致。加樣時以加滿小孔為度，注意不能讓液體溢出。 － ＋ Ag Ab Ag Ab 4、電泳：將加好樣的瓊脂板放置電泳槽上，抗原孔置負極端，抗體孔置正極端。瓊脂板兩端分別用雙層濾紙片與電泳槽中的pH8.6的巴比妥鈉緩沖液相連，接通電源，調(diào)節(jié)電流為2—4mA/cm板寬或電壓為4—6V/cm板長，電泳45—60分鐘。 5、電泳畢，關(guān)掉電源，取出瓊脂板，觀察在相應(yīng)抗原抗體孔間有無白色沉淀線出現(xiàn)。 【結(jié)果】 陽性對照孔與抗血清孔間出現(xiàn)清晰白色沉淀線。若待檢血清與抗血清孔間出現(xiàn)沉淀線為陽性，反之無沉淀線為陰性。若沉淀線不夠清晰，可在37℃下放置數(shù)小時，以增強沉淀線清晰度。 【注意事項】 1． 對流免疫電泳試驗的靈敏度較雙向免疫擴散試驗高，但由于電泳時緩沖液的離子強度、pH值、端電壓和電泳時間等因素的影響，有時可能出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。 2． 抗原與抗體量應(yīng)相接近，如抗原量過多，可造成假陰性結(jié)果，須通過稀釋抗原加以解決。 三 動物（豚鼠)過敏試驗
【原理】 豚鼠過敏試驗屬Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，與人類的青霉素和異種血清蛋白引起的過敏性休克相似，通過了解動物實驗性過敏性休克的方法及結(jié)果觀察，有助于加深和理解Ⅰ型超敏反應(yīng)的主要特點，發(fā)病機制及臨床表現(xiàn)。其基本原理是先給豚鼠注射異種蛋白，經(jīng)過一段時間，動物產(chǎn)生IgE等親細胞型抗體，吸附于體內(nèi)組織中的肥大細胞及血液中的嗜鹼性粒細胞，使機體對該變應(yīng)原（異種蛋白)處于致敏狀態(tài)。當?shù)诙谓o處于致敏狀態(tài)的動物注射相同變應(yīng)原時，變應(yīng)原與肥大細胞和嗜鹼性粒細胞表面的IgE結(jié)合，引起肥大細胞和嗜鹼性粒細胞膜構(gòu)型改變，細胞脫顆粒，釋放多種活性介質(zhì)，作用于相應(yīng)效應(yīng)器官，引起各種過敏癥及過敏性休克 【材料】 1．動物：體重150克左右的幼小豚鼠2只。 2．變應(yīng)原：雞蛋白。 3．注射器、針頭、酒精棉球 【方法】 1． 致敏注射：取健康豚鼠2只，分別編為1號、2號。 ①于1號豚鼠腹腔注射1:10卵白蛋白1ml ②2號豚鼠不注射 2．發(fā)敏注射：經(jīng)14~21天致敏后，2只豚鼠分別同時心內(nèi)注射1:10稀釋卵白蛋白1-2ml，觀察各豚鼠行為表現(xiàn)有何差異。 【結(jié)果】 1、1號豚鼠很快出現(xiàn)煩燥不安，聳毛、抓鼻、打噴嚏、痙攣性跳躍、大小便失禁等癥狀，重者數(shù)分鐘內(nèi)由于呼吸肌痙攣窒息而死亡。 2、2號豚鼠無任何癥狀發(fā)生。 檢測可溶性抗原 做清潔 | 講授、示教 ―――― 講授 板書 示教 講授 板書 示教 ――――― 講授 板書 示教 | 約10min ―――― 約70min 約30min 約5min ―――――― 約35min ― 40min 約5min |
小 結(jié) | 1、對流免疫電泳的原理 2、對流免疫電泳的方法 3、對流免疫電泳的應(yīng)用 4、動物過敏試驗的原理 |
復(fù) 習 思 考 題 、 作 業(yè) 題 | 思考題 1 對流免疫電泳的優(yōu)點和缺點？ 2 Ⅰ型超敏反應(yīng)的發(fā)生機制及相關(guān)臨床表現(xiàn)？ |
下 次 課 預(yù) 習 要 點 | 教學錄像內(nèi)容： 一．免疫應(yīng)答 二．淋巴細胞分離技術(shù) 三．艾滋病防治常識 |
實 施 情 況 及 分 析 |
