簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)體會(huì)

一、利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列

 因?yàn)槊艽a子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp(通過(guò)蛋白查蛋白)，在整個(gè)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中中查找與醫(yī)學(xué)全.在線gydjdsj.org.cn之相似的氨基酸序列。

二、對(duì)所找到的序列進(jìn)行多序列比對(duì)

   將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，可選工具有Clustal W，也可在線分析http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。其結(jié)果入下圖所示,所有序列的共有部分將會(huì)顯示出來(lái)。“*”表示保守，“：”表示次保守。

三、確定合適的保守區(qū)域

設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域，且兩個(gè)保守區(qū)域相距50～ 400個(gè)aa為宜，使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)aa殘基，因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。若比對(duì)結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個(gè)aa的保守區(qū)域，這時(shí)可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進(jìn)行二次比對(duì)，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進(jìn)行三次比對(duì)�？傊�，究竟要選多少序列來(lái)比對(duì)，要根據(jù)前一次比對(duì)的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個(gè)6個(gè)aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。

四、利用軟件設(shè)計(jì)引物

當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專(zhuān)業(yè)的軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物了，其中pp5支持簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)請(qǐng)見(jiàn)http://www.dxy。cn/bbs/post/view?bid=67&id=8798113&sty=1)，將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡(jiǎn)并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差以個(gè)核苷酸的序列群，該群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來(lái)表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T)，該具有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對(duì)應(yīng)部分，在pp5中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，總之要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會(huì)有數(shù)對(duì)，分?jǐn)?shù)越高越好。

五、對(duì)引物的修飾

若得到的引物為：

5-NAGSGNGCDTTANCABK-3

則其簡(jiǎn)并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡(jiǎn)并度多高不利于pcr。我們可以通過(guò)用次黃嘌呤代替N（因?yàn)榇吸S嘌呤能很好的和4種堿基配對(duì))和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來(lái)降低簡(jiǎn)并度（有個(gè)查密碼子偏好的數(shù)據(jù)庫(kù)我以前發(fā)過(guò)大家搜索一下把)。

最后，這樣子設(shè)計(jì)出來(lái)簡(jiǎn)并引物對(duì)，適用于用于比對(duì)的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類(lèi)地位相同的其他物種。