五、增加染色強(qiáng)度方法
通常染色、著色較弱時(shí)，應(yīng)想辦法改進(jìn)標(biāo)本的處理的抗原的保存，提高抗體的穿透力，再重新染色。但有時(shí)組織本身抗原含量較少或標(biāo)本難得（如手術(shù)材料)，可嘗試下述方法以提高染色強(qiáng)度，確保染色成功。
1．重復(fù)顯色 一般認(rèn)為，對(duì)ALP標(biāo)記抗體，延長(zhǎng)顯色時(shí)間其反應(yīng)可增強(qiáng)。但在同一染色液中延長(zhǎng)顯色時(shí)間，往往容易產(chǎn)生沉淀，出現(xiàn)終產(chǎn)物彌散現(xiàn)象。所以重新配制顯色液繼續(xù)呈色，第二孵育時(shí)間可縮短至4～5min，能提高部分染色強(qiáng)度。
HRP標(biāo)記時(shí)，重復(fù)呈色無(wú)明顯增強(qiáng)效應(yīng)。通常在顯色液中加入0.01mol/l Imidazole 或改用酸性緩沖液（pH5.5～6.0)，可提高染色強(qiáng)度；亦可在DAB反應(yīng)后，1%OSO4浸泡固定5～15min，繼之0.4%亞鐵氰化鉀/0.1N HCl液處理5min，DAB終產(chǎn)物呈黑色，與背景的對(duì)比度較佳。另外，在間接法顯色較弱時(shí)，亦可試用PAP法、ABC法等，探索較合適的染色方法。
2．重復(fù)第一抗體 在漂洗過(guò)程中，結(jié)合力弱的抗體易離解丟失，重復(fù)應(yīng)用第一抗體有利于抗體與組織抗原結(jié)合，增加抗體數(shù)量，提高染色強(qiáng)度（Noorden 1983)。切片經(jīng)第一抗體孵育后，漂洗，再孵育第一抗體（此時(shí)第一抗體可稀釋較原工作濃度1至數(shù)倍)2～4h，然后經(jīng)酶標(biāo)抗體孵育，呈色觀(guān)察同前。所用抗體為多克隆血清時(shí)，提高第一抗體的稀釋度，重復(fù)孵育2～3次，可得到一定效果。單克隆抗體，經(jīng)第一抗體—酶標(biāo)抗體—第一抗體—酶標(biāo)抗體，也能增加染色強(qiáng)度。醫(yī)學(xué).全在.線(xiàn)www.med126.com
3．雙橋PAP法（Vacca 1982) 基本操作與單橋法相似，所不同的是切片經(jīng)單橋PAP復(fù)合物孵育后，漂洗，再孵育橋抗體和PAP復(fù)合物（均可稀釋1倍)，即切片經(jīng)兩次橋抗體、兩次PAP孵育—雙橋法（Double bridged technique)。據(jù)報(bào)告，第一抗體用較高稀釋度（例單橋法兩倍)，也能獲得與雙橋法相近的染色效果。
理論上講，雙橋法是ICC染色中較為敏感的方法，它較單橋法靈敏20～50倍，能夠增加抗原的顯示數(shù)量（25%)和反應(yīng)終產(chǎn)物的大小。這在研究胚胎發(fā)育過(guò)程中一些抗原含量較低的組織時(shí)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。雙橋法可能是通過(guò)下列途徑提高其敏感性的：①重復(fù)的橋抗體與PAP復(fù)合物中的抗HRP抗體的未飽和抗原位置結(jié)合，再連結(jié)另外的PAP復(fù)合物，在抗原部位抗體間彼此結(jié)合形成較大的抗原抗體復(fù)合物，具有多個(gè)酶分子（圖4-9A)，使反應(yīng)增強(qiáng)。這可能是雙橋法敏感性增高的主要機(jī)制；②重復(fù)的橋抗體與第一抗體未飽和的抗原位置結(jié)合，使第一抗體上結(jié)合較多的橋抗體及PAP復(fù)合物（圖4-9B)。但PAP復(fù)合物較大，應(yīng)設(shè)法提高其穿透性，達(dá)到增加染色強(qiáng)度的目的。
圖4-9 雙橋PAP法的兩種放大原理
4．半抗原夾層法（Hapten Sandwich Method) 首先用半抗原（FITC等)標(biāo)記的第一抗體與組織抗原結(jié)合，繼之用HRP（或ALP)標(biāo)記的抗FITC抗體與組織抗原結(jié)合的FITC的反應(yīng)，呈色后觀(guān)察抗原存在部位。FITC為一種熒光色素，熒光顯微鏡下呈亮綠色熒光，所以也可以同時(shí)觀(guān)察免疫熒光染色結(jié)果。FITC特異熒光褪色后，其抗原性仍不丟失，從這種角度講，熒光抗體法的切片亦能半永久保存。該法較一般間接法敏感性高，最大優(yōu)點(diǎn)是不管第一抗體來(lái)自何種屬，只要與FITC連結(jié)，均可被同一酶標(biāo)記的抗FITC抗體識(shí)別。避免了準(zhǔn)備不同種屬的酶標(biāo)抗體的麻煩，而且FITC標(biāo)記抗體技術(shù)成熟、穩(wěn)定，商品種類(lèi)多，容易購(gòu)買(mǎi)，實(shí)驗(yàn)者不妨一試。
