抗血清的純化與保存-臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)主任醫(yī)師2014年輔導(dǎo)資料
抗血清的純化與保存是臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)主任醫(yī)師考試需要了解的知識(shí)點(diǎn)，醫(yī)學(xué)全在線小編搜集整理了相關(guān)資料，便于各位同學(xué)復(fù)習(xí)備考，順利通過(guò)考試！
（1)采血：加強(qiáng)免疫的動(dòng)物2—3次后，可通過(guò)耳靜脈或眼球（小鼠)采血，進(jìn)行抗血清效價(jià)測(cè)定。當(dāng)效價(jià)達(dá)到理想的高度后，可以采血。采血方式可以從心臟直接取血，也可通過(guò)動(dòng)脈放血。待血液凝固后用針筒或吸管吸取血清。
（2)抗血清的純化與保存：除抗體外血清中含有多種其他蛋白成分醫(yī)學(xué)、教育網(wǎng)搜集整理。為了避免這些蛋白質(zhì)干擾抗體（免疫球蛋白)標(biāo)記反應(yīng)和抗原抗體反應(yīng)，抗血清可經(jīng)過(guò)純化以獲得單一的機(jī)體（常為IgG)組分。常用的純化IgG的方法為飽和硫酸胺鹽析和層析法。蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度的溶液中，其溶解度不一樣，鹽離子干擾蛋白質(zhì)和水分子間氫鍵形成，因?yàn)樗}結(jié)合比水—蛋白質(zhì)結(jié)合更穩(wěn)定，蛋白質(zhì)即可從溶液中沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)分子越大，沉淀時(shí)所需鹽離子濃度越低。免疫球蛋白（Mr1.5×105)比血清中主要蛋白質(zhì)白蛋白（Mr6.7×104)的分子大得多，抗體在30%—50%飽和度的硫酸鹽中析出，而白蛋白需在70%—80%飽和度才析出，因此常用33%飽和度的硫酸胺純化血清中的IgG.鹽析時(shí)為了減少抗體變性，需在4℃進(jìn)行，同時(shí)用pH8.0緩沖液稀釋抗血清，以減少蛋白濃度過(guò)高而發(fā)生共沉淀。醫(yī)。學(xué)教育網(wǎng)搜集整理銨鹽的溶解度不隨溫度變化而明顯改變，0℃和25℃僅差3%，而鈉鹽則相差5倍，因此常在低溫沉淀時(shí)用銨鹽，室溫沉淀用鈉鹽。銨鹽對(duì)抗體的標(biāo)記反應(yīng)（如FITC和biotin標(biāo)記時(shí))有一定的干擾作用醫(yī).學(xué).全.在.線www.gydjdsj.org.cn。
鹽析法只能部分純化抗體，更高純度的抗體制劑可用層析法制備。IgM五聚體相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)9.7×10，比血清中任何其他蛋白都大，用分子篩層析很容易將其純化。IgG在PH8.0時(shí)帶負(fù)電荷，能與DEAE纖維素上的陽(yáng)離子結(jié)合，因此可用離子交換層析來(lái)純化IgG.IgG純化最常用的方法為親和層析。IgG與葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白具合高度的親和性，可用這兩種蛋白質(zhì)交聯(lián)親和層析柱將IgG純化。大部分IgG與蛋白A結(jié)合PH為8—9，洗脫P(yáng)H為2—4；而與蛋白G的結(jié)合PH為5—7，洗脫P(yáng)H為9—10.C蛋白更適合于IgG的純化，不但反應(yīng)條件為溫和的弱酸性或弱堿性，并且與IgG的結(jié)合力高于A蛋白。G蛋自能與大部分動(dòng)物種類的IgG結(jié)合，而A蛋白對(duì)小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、馬和綿羊IgG結(jié)合力弱或不能結(jié)合G蛋白和A蛋白均不能與雞IgG結(jié)合。
抗血清或純化的抗體在低溫保存可維持活性數(shù)年，反復(fù)凍融使抗體很快失活，被細(xì)菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀釋的抗血清加入防腐劑疊氮化鈉和保護(hù)劑如BSA等可于4℃保存。長(zhǎng)期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于50%飽和硫酸銨中4℃保存，還可以冷凍干燥保存。
