色譜法
色譜法是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法。先將混合物中各組分分離而后逐個(gè)分析，是分析化合物有力手段。具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。
第一節(jié) 概論
一、基本原理
色譜過(guò)程是物質(zhì)分子在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相(固定相和流動(dòng)相)間分配平衡的過(guò)程，可用分配系數(shù)K和容量因子k描述。醫(yī),學(xué).全,在.線gydjdsj.org.cn
1.分配系數(shù)K=Cs/Cm，與組分、固定相和流動(dòng)相性質(zhì)和溫度有關(guān)。
2.容量因子k＝Ws/Wm，不僅與組分、固定相和流動(dòng)相性質(zhì)和溫度有關(guān)，還與兩相體積有關(guān)。容量因子不等是色譜分離的先決條件。
3.色譜過(guò)程方程：保留時(shí)間與分配系數(shù)關(guān)系tR=t0(1+k)
二、分類
1．按分離原理
(1) 吸附色譜法：固定相為固體
(2) 分配色譜法：固定相為液體
(3) 離子交換色譜法：固定相為離子交換樹(shù)脂
(4) 分子排阻色譜法：固定相為多孔填料
2．按操作形式：平面色譜、柱色譜、電泳法
3．按兩相物態(tài)：氣相色譜、液相色譜
第二節(jié) 薄層色譜法
一、基本原理
吸附劑對(duì)不同組分A和B具有不同吸附能力，展開(kāi)劑也對(duì)A和B有不同溶解、解吸能力，當(dāng)展開(kāi)劑不斷展開(kāi)，A、B在吸附劑和展開(kāi)劑之間連續(xù)不斷吸附解吸，產(chǎn)生差速遷移得到分離。
二、固定相
1．硅膠：含水量越高，活性越低，吸附力越弱。在105～110℃加熱30min，使其活化。硅膠G、硅膠H、硅膠GF254、硅膠HF254的含義
2．氧化鋁：堿性、中性和酸性三種�；钚耘c含水量有關(guān)
3．聚酰胺：可與酚羥基、羧基、氨基酸形成氫鍵，選擇性高
三、操作方法
1．制備：1份固定相與3份水混和涂布，110℃烘30分鐘
2．點(diǎn)樣與展開(kāi)：點(diǎn)樣一般為直徑2～4mm圓點(diǎn)，距底2.0cm；展開(kāi)距離一般為10～15cm。
3．檢視：熒光板在紫外光下檢視；普通薄層板用物理方法或顯色劑顯色。
4．系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
比移值：Rf＝l/l0，為組分遷移距離與展開(kāi)劑遷移距離之比
比移值的最佳范圍是0.3～0.5，可用范圍是0.2～0.8。
影響比移值因素：①被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。極性較強(qiáng)的組分Rf較小。②薄層板性質(zhì)。吸附劑活性越強(qiáng)，Rf較小。③展開(kāi)劑性質(zhì)。極性越強(qiáng)展開(kāi)劑Rf值增大④展開(kāi)劑蒸氣飽和程度。
3.分離度：R=2d/(W1+W2)，兩相鄰斑點(diǎn)中心距離與兩斑點(diǎn)平均寬度的比值
四、應(yīng)用醫(yī),學(xué).全,在.線gydjdsj.org.cn
1.鑒別：比較供試品與對(duì)照品溶液的比移值
2.雜質(zhì)檢查：雜質(zhì)對(duì)照品比較法；自身稀釋對(duì)照法
第三節(jié) 高效液相色譜法
一、基本原理
1．基本概念
色譜峰參數(shù)：峰高或峰面積(用于定量)，峰位(保留值表示，用于定性)，峰寬(用于衡量柱效)
保留值：保留時(shí)間、死時(shí)間、調(diào)整保留時(shí)間
峰寬：標(biāo)準(zhǔn)差、半峰寬、峰寬
2.塔板理論：把組分在兩相間的連續(xù)轉(zhuǎn)移過(guò)程，分解為間歇的在單個(gè)塔板中的分配平衡過(guò)程
理論塔板數(shù) n=5.54(tR/Wh/2)2
色譜柱的理論塔板數(shù)越多，柱效越高；同樣長(zhǎng)度中塔板高度越小，柱效越高。
3.速率理論：主要說(shuō)明使色譜峰擴(kuò)張而降低柱效的因素
范氏方程 H=A+B/μ+Cμ
A為渦流擴(kuò)散項(xiàng)。采用適當(dāng)粒度、均勻的填料并填充均勻可減小渦流擴(kuò)散
B為縱向擴(kuò)散系數(shù)。流動(dòng)相為液體，柱溫為室溫，B/μ可忽略不計(jì)
C為傳質(zhì)阻抗系數(shù)。在能完全覆蓋載體表面的前提下，應(yīng)適當(dāng)減少固定液用量。
二、高效液相色譜儀
1.高壓輸液泵
2.色譜柱：分析型和制備型
3.進(jìn)樣閥
4.檢測(cè)器
（1)選擇性檢測(cè)器：與待測(cè)物濃度、結(jié)構(gòu)有關(guān)
①紫外檢測(cè)器：靈敏度、重復(fù)性及線性范圍較好，適用于具有共軛結(jié)構(gòu)的化合物的檢測(cè)
②光二極管陣列檢測(cè)器：檢測(cè)原理相同，可同時(shí)記錄待測(cè)物吸收光譜，用于光譜鑒定和純度檢查
③熒光檢測(cè)器：靈敏，用于在流動(dòng)相條件下具有熒光或經(jīng)衍生轉(zhuǎn)化為具有熒光的化合物的檢測(cè)
④電化學(xué)檢測(cè)器：靈敏度高，僅用于在流動(dòng)相條件下發(fā)生氧化－還原反應(yīng)的化合物
⑤質(zhì)譜檢測(cè)器：高靈敏度、高選擇性、分析范圍廣；不適用于小分子化合物，主要用于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多肽的檢測(cè)
（2)通用性檢測(cè)器：質(zhì)量型檢測(cè)器
①示差折光檢測(cè)器：僅對(duì)少數(shù)物質(zhì)如糖類靈敏度較高，受環(huán)境溫度影響大，實(shí)際應(yīng)用少
②蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：適用于UV檢測(cè)困難的物質(zhì)的分析，響應(yīng)值與濃度通常不呈線性關(guān)系。
三、吸附色譜法
1．原理：被分離組分與流動(dòng)相對(duì)吸附劑吸附能力的差異
2．常用固定相和流動(dòng)相
固定相：硅膠、氧化鋁、高分子多孔微
流動(dòng)相：烷烴加極性調(diào)節(jié)劑；極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)
四、分配色譜法
1．原理：被分離組分溶入互不相溶的固定相與流動(dòng)相，達(dá)到平衡后濃度之比（分配系數(shù))的差異
正相分配色譜：流動(dòng)相極性小于固定相極性。極性小的組分先流出，極性大的組分后流出。用于分離極性及中等極性物質(zhì)醫(yī),學(xué).全,在.線gydjdsj.org.cn
反相分配色譜：流動(dòng)相極性大于固定相極性。極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。應(yīng)用廣泛，用于分離非極性至中等極性物質(zhì)
離子對(duì)反相色譜：在流動(dòng)相中加入有機(jī)離子對(duì)試劑，用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離
離子抑制色譜：調(diào)整流動(dòng)相pH，抑制組分的解離
2．常用固定相和流動(dòng)相
（1)固定相：化學(xué)鍵合相
非極性：十八烷基硅烷鍵合硅膠
極性：氨基和氰基硅烷鍵合相
（2)流動(dòng)相
正相色譜：烷烴加極性調(diào)節(jié)劑
反相色譜：甲醇－水、乙腈－水
五、色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
固定相種類、流動(dòng)相組成、檢測(cè)器類型不得改變，其余可適當(dāng)改變以達(dá)到色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求
1.理論塔板數(shù)：不得低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論塔板數(shù)
2.分離度：除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5
3.重復(fù)性：取各品種項(xiàng)下對(duì)照品2連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0％
4.拖尾因子：除另有規(guī)定外，拖尾因子應(yīng)在0.95～1.05之間
六、應(yīng)用
1.鑒別：利用保留值進(jìn)行鑒別。
2.檢查
(1) 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)含量
(2) 外標(biāo)法測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)含量
(3) 加校正因子的主成分自身對(duì)照法
(4) 不加校正因子的主成分自身對(duì)照法
(5) 面積歸一化法：一般不用于微量雜質(zhì)檢查
3.含量測(cè)定：外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)法
內(nèi)標(biāo)物要求：①原樣品中不含有的組分；②保留時(shí)間與待測(cè)組分相近，但能完全分離；③純度合乎要求。
第四節(jié) 氣相色譜法
一、基本原理
以氣體為流動(dòng)相的色譜法，具有分離效能高、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，不適用于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)分析。
分類：吸附色譜和分配色譜；氣－固色譜和氣－液色譜；填充柱色譜和毛細(xì)管色譜
二、氣相色譜儀
1.氣源：FID常用載氣多為氮?dú)饣蚝�；TCD多用氦氣或氫氣為載氣；ECD多用氮?dú)饣驓鍤?BR>2.進(jìn)樣方式：溶液直接進(jìn)樣；頂空進(jìn)樣
3.色譜柱和柱溫箱：填充柱和毛細(xì)管柱
4．檢測(cè)器
火焰離子化檢測(cè)器FID：靈敏度高、響應(yīng)快、線性范圍寬，最常用。
氮磷檢測(cè)器NPD：適用于含氮、磷元素的藥物
火焰光度檢測(cè)器FPD：適用于含磷、硫元素的藥物
電子捕獲檢測(cè)器ECD：主要用于含鹵素的藥物
質(zhì)譜檢測(cè)器MS：高靈敏度、高專屬性，可用于結(jié)構(gòu)確證
熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD：構(gòu)造簡(jiǎn)單、測(cè)定范圍廣、樣品不破壞，但靈敏度較低。
三、常用固定液與載體
1．固定液
烴類：標(biāo)準(zhǔn)非極性固定液
硅氧烷類：通用型固定液
醇類：氫鍵型固定液
2．載體：化學(xué)惰性的多孔微粒，常用硅藻土
3．毛細(xì)管色譜柱
開(kāi)管型：涂壁毛細(xì)管柱、載體涂層毛細(xì)管柱
填充型
四、色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)醫(yī),學(xué).全,在.線gydjdsj.org.cn
檢測(cè)器種類、固定液品種及特殊指定的色譜材料不得改變。
五、應(yīng)用
標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法：配制雜質(zhì)對(duì)照品溶液，精密加入到供試品中，測(cè)定雜質(zhì)含量，再扣除加入對(duì)照品溶液量。
采用頂空進(jìn)樣時(shí)，該法可消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。該法與其他方法結(jié)果不一致時(shí)以本法結(jié)果為準(zhǔn)。
第五節(jié) 電泳法
一、基本原理
電泳遷移速度 ν＝μE
在相同電場(chǎng)強(qiáng)度下，兩組分分離程度取決于二者淌度之差。電泳分離后各組分的相對(duì)位置由組分的電泳泳動(dòng)和緩沖液電滲共同決定。
影響電泳分離的條件包括：
1.緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度：pH直接影響組分的荷電情況，是電泳分離的最重要條件。離子強(qiáng)度太小則緩沖容量不足，區(qū)帶易擴(kuò)散；太大則組分移動(dòng)慢，發(fā)熱嚴(yán)重。
2.電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度越大分離越完全，大于20V/cm時(shí)發(fā)熱嚴(yán)重。
3.樣品濃度：通常以1％為宜。太濃拖尾，太稀測(cè)定結(jié)構(gòu)精密度差。
二、各類電泳法
1.紙電泳法
2.醋酸纖維素電泳法
3.瓊酯糖凝膠電泳法
4.聚丙烯酰胺凝膠電泳法
5.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法
三、毛細(xì)管電泳法
以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依照樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的方法。
1．毛細(xì)管區(qū)帶電泳
2．毛細(xì)管凝膠電泳
3．毛細(xì)管等速電泳
4．毛細(xì)管等電聚焦電泳
5．膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜
6．毛細(xì)管電色譜
第七章 藥物的雜質(zhì)檢查
第一節(jié) 雜質(zhì)和雜質(zhì)的限量檢查
一、雜質(zhì)來(lái)源和分類
1.雜質(zhì)是指藥物中存在的無(wú)治療作用或影響藥物的穩(wěn)定性和療效，甚至對(duì)人健康有害的物質(zhì)。
2.雜質(zhì)的來(lái)源，主要有兩個(gè)：
一是由生產(chǎn)過(guò)程中引入。（精制未能完全除去，原料不純或存在反應(yīng)不完全，中間產(chǎn)物與副產(chǎn)物)。
二是在貯藏過(guò)程中產(chǎn)生。（貯藏過(guò)程外界條件影響，或因微生物的作用，發(fā)生水解、氧化、分解、異構(gòu)化、晶型轉(zhuǎn)變、聚合、潮解和發(fā)霉等變化，產(chǎn)生有關(guān)的雜質(zhì))。
3.雜質(zhì)按來(lái)源分類，可分為一般雜質(zhì)和特殊雜質(zhì)。一般雜質(zhì)是指在自然界中分布較廣泛，在多種藥物生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中容易引入的雜質(zhì)，如酸、堿、水份、氯化物、硫酸鹽等。一般雜質(zhì)檢查方法收載在藥典附錄中。特殊雜質(zhì)是指在個(gè)別藥物的生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中引入的雜質(zhì)，檢查方法收載在該藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。
雜質(zhì)按其性質(zhì)還可分為信號(hào)雜質(zhì)和有害雜質(zhì)，信號(hào)雜質(zhì)本身一般無(wú)害，其含量多少可以反映出藥物純度水平。有害雜質(zhì)如重金屬、砷鹽，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中要嚴(yán)格控制，以保證用藥安全。
二、雜質(zhì)的限量檢查
由于雜質(zhì)不可能完全除盡，所以在不影響療效和不發(fā)生毒性的原則下，既保證藥物質(zhì)量，又便于制造、貯藏和制劑生產(chǎn)，對(duì)于藥物中可能存在的雜質(zhì)，允許有一定限量，通常不要求測(cè)定其準(zhǔn)確含量�！端幍洹分幸�(guī)定的雜質(zhì)檢查均為限量（或限度)檢查。
雜質(zhì)限量：指藥物中所含雜質(zhì)的最大容許量。
表示方法：通常用百分之幾或百萬(wàn)分之幾(ppm)來(lái)表示。對(duì)危害人體健康、影響藥物穩(wěn)定性的雜質(zhì)，必須嚴(yán)格控制其限量。檢查時(shí)可用雜質(zhì)的純品或?qū)φ掌吩谙嗤瑮l件下來(lái)比較。
限量計(jì)算：雜質(zhì)限量=雜質(zhì)最大允許量/供試品量 ×100%
=標(biāo)準(zhǔn)溶液體積×標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度/供試品 ×100%
或 L=V×C/S ×100%
