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五、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白分子量,是根據(jù)大多數(shù)蛋白都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結(jié)合成復(fù)合物,使蛋白分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然蛋白分子的負(fù)電荷，消除了不同蛋白分子的電荷效應(yīng),使蛋白分子相對遷移率(R''<[m]>)的大小完全取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的對數(shù)和相對遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出供試品的分子量。
1.儀器裝置
除另有規(guī)定外，同聚丙烯酰胺凝膠電泳。
2.試劑
(1)丙烯酰胺液溶
稱取丙烯酰胺22.2g與雙丙烯酰胺0.6g， 溶于100ml水中，貯于褐色瓶中低溫保存。
(2) 凝膠緩沖液
稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)8.82g 、磷酸氫二鈉(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g與十二烷基硫酸鈉2.0g，加水至1000ml(若有沉淀析出,可加溫至37℃溶解)。
(3)電泳緩沖液
將凝膠緩沖液稀釋1倍。
(4)染色液
稱取25mg考馬斯亮藍(lán)R<[250]>,溶于57％乙醇與9.2％醋酸混合液100ml中。
(5)脫色液
取無水乙醇75ml，加冰醋酸50ml，用水稀釋至1000ml。
3.操作法
除下列規(guī)定外，其他均同聚丙烯酰胺凝膠電泳。
(1)制膠
用丙烯酰胺溶液－凝膠緩沖液－水－1.6％過硫酸銨溶液-四甲基乙二胺(需冷卻)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配制而成。
(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液及供試品溶液的制備醫(yī).學(xué)全.在.線gydjdsj.org.cn
取標(biāo)準(zhǔn)蛋白，加水制成每1ml中含2～5mg的溶液，與水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸鈉0.04g，溶于40ml水中)1∶3混合，置冰箱中過夜。供試品照上述方法配制。
(3)電泳
調(diào)節(jié)電流使每管為8mA。
4.相對遷移率和分子量計(jì)算
將電泳脫色后的區(qū)帶用卡尺或用掃描定位法測量染料移動(dòng)的距離、染色前膠條長度、蛋白移動(dòng)距離和脫色后的膠條長度。按下式計(jì)算相對遷移率：
蛋白移動(dòng)的距離 染色前的膠條長度
相對遷移率(R''<[m]>)＝──────────×──────────
脫色后的膠條長度 染料移動(dòng)的前沿距離
以R''<[m]>為橫坐標(biāo),已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的對數(shù)為縱坐標(biāo),在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪圖,由標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出供試品分子量。 上一頁 [1] [2] [3]
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