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3）分離后測定：
（1）柱色譜法：如維生素K1注射液的測定方法，中國藥典（1985版）采用三甲基戊烷提取后，將提取液經(jīng)過含7%水的中性氧化鋁色譜柱，以乙醚-三甲基戊烷（1：49）洗脫，流速約1ml/min，收集洗脫液后，于249nm波長處測得吸收度，按吸收系數(shù)（E1 m）為420計算，即得。（90版后改為HPLC法）
丙酸睪酮注射液的含量測定可采用反相分配柱色譜法，若油溶劑中含甾醇和三萜類雜質(zhì)較多時，可選用一反相柱A和一正相柱B串聯(lián)的形式，其柱系統(tǒng)如下：
A B
支持劑 硅烷化硅藻土（極性小） 硅藻土（極性大）
固定相 正庚烷（用95%乙醇飽和） 硝基甲烷
流動相 95%乙醇（用正庚烷飽和） 正庚烷
測定時，量取相當(dāng)于50mg丙酸睪酮的注射液，注入A柱中，則溶劑油被滯留在A柱上，經(jīng)流動相洗脫，丙酸睪酮、甾醇及三萜類將被洗脫下來；然后將洗脫液流入B柱，用正庚烷洗脫，此時，甾醇和三萜類雜質(zhì)滯留在B柱上，丙酸睪酮被洗脫于正庚烷中。將正庚烷洗脫液用95%乙醇稀釋后，用紫外分光光度法進行測定。
若油溶劑中含甾醇和三萜類雜質(zhì)很少時，可用一根反相柱，將供試品注入后，以95%乙醇洗脫，油溶劑滯留在A柱上，紫外分光光度法測定。（USP21）測定丙酸睪酮油注射液用此法。
（2）高效液相色譜法：藥典對一些甾體激素類藥物的油注射液，如丙酸睪酮注射液、苯丙酸諾龍注射液、維生素E注射液、及黃體酮注射液等，均采用HPLC法測定。
黃體酮測定方法如下：
色譜條件：用碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的分離柱，以甲醇-水（70：30）的混合液為流動相，流速1ml/min，于254nm波長處檢測，理論塔板數(shù)按黃體酮的峰計算應(yīng)不低于600，黃體酮與內(nèi)標(biāo)物的分離度應(yīng)符合要求。 醫(yī)學(xué)全在線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn
校正因子的測定：取黃體酮對照品約25mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。另取己稀雌酚約18mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。精密量取對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各5ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5~10μl注入高效液相色譜儀，記錄色譜
圖，按下式計算校正因子供試品溶液的制備與測定：用內(nèi)容量移液管精密量取本品適量（約相當(dāng)于黃體酮50mg），置 50ml量瓶中，用乙醚分?jǐn)?shù)次洗滌移液管內(nèi)壁，洗液并入容量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml置具塞離心管中，在溫水浴中使乙醚揮散，用甲醇振搖提取4次（第1~3次各5ml，第4次3ml），每次振搖10分鐘，離心15分鐘，并用滴管將甲醇液移至25ml量瓶中，合并提取液，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液（己烯雌酚）5ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5~10μl注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)發(fā)以峰面積計算即得。
上述操作中，選用乙醚作溶劑的原因使黃體酮和溶劑油均易溶于乙醚中，這樣可準(zhǔn)確的量取供試品，同時也易于揮散；黃體酮易溶于甲醇，而油溶劑則不溶，因此，選用甲醇將黃體酮提取分離后進行測定，溶劑油的干擾就被排除了。
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