中國幽門螺桿菌研究:ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體

1983年Warren和Marshall從人胃粘膜成功地分離出幽門螺桿菌（Hp)之后，Hp與胃炎、消化性潰瘍的相關(guān)性引起人們極大的興趣。人們推測其可能成為這類疾病的致病因素之一。許多研究者正進(jìn)一步探索其致病機(jī)理，并從不同角度尋找快速、可靠的檢測方法。迄今為止，檢測Hp的方法包括組織標(biāo)本培養(yǎng)，切片染色，細(xì)菌直接涂片染色，快速尿素酶測定及¹³C尿素呼吸試驗(yàn)和¹⁴C尿素呼吸試驗(yàn)等。除尿素呼吸試驗(yàn)外其余方法均需通過胃鏡檢查才能完成，鑒于取材困難，進(jìn)一步尋找檢測Hp感染的免疫學(xué)方不進(jìn)非常必要的。國外有人用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)檢測臨床病人血清中有Hp抗體報(bào)道，國內(nèi)尚未有這方面研究報(bào)告。本文報(bào)道建立一種檢測人體抗Hp抗體的ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及與細(xì)菌培養(yǎng)法和尿素酶測定法對比檢測結(jié)果，研究證明本法特異、敏感、適用于大量標(biāo)本普查和及時(shí)判斷治療反應(yīng)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料和方法

1.1　材料

①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：上海塑料三廠產(chǎn)品。②酶聯(lián)板離心籃：根據(jù)40孔酶聯(lián)板本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)制成。③DG—Ⅰ型酶聯(lián)免疫檢測儀：南京華東電子管廠產(chǎn)品。④試劑：過氧化物酶（HRP)，R²＝3.2，美國Sigma公司產(chǎn)品。鄰苯二胺（OPD)：上海白鶴化工廠產(chǎn)品，按文獻(xiàn)配制。包被液：取碳酸鈉1.59g加碳酸氫鈉2.93g，蒸餾水1000ml配成。洗滌液：以上未加吐溫—20的洗滌液100ml＋2％小牛血清＋4％聚乙二醇（PEG)。封板液：5％小牛血清。戊二醛固定液：25％戊二醛液，100ml裝，Kochligh進(jìn)口分裝，用時(shí)稀釋成0.25％戊二醛固定液。終止液：2NH₂SO₄。⑤抗原的制備：將澳大利亞皇家佩思醫(yī)院的Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株（NCTC11638)及從胃鏡檢查患者胃粘膜活檢標(biāo)本分離出的Hp菌株分別接種于心腦血平板，37℃培養(yǎng)5d后取菌落作生化與血清學(xué)鑒定（自制兔抗Hp抗體)，然后取單個(gè)菌落移種于另一血平板，繼續(xù)培養(yǎng)3d，經(jīng)鑒定后將其大量增殖培養(yǎng)，3d后將菌苔刮下，置生理鹽水中制成菌液，加福爾馬林固定（0.1％～0.3％)，4℃過夜，3000r/nin離心30min，沉淀3次，將最后1次沉淀懸于少量PBS液內(nèi)，用比濁管沒出細(xì)菌濃度，制成含菌3×10⁹ml，置冰箱冰凍，反復(fù)凍融3次，經(jīng)顯微鏡檢查無菌體存在后，制成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，－20℃保存?zhèn)溆�。⑥臨床血清標(biāo)本：采自胃鏡檢查患者，隨機(jī)采取1988年8～10月胃鏡檢查病人共38人，抽靜脈血2ml，分離血清貯存－20℃?zhèn)溆�。⑦陰性對照血清，進(jìn)行ELISA測定，取其平均OD值作對照。⑧酶標(biāo)羊抗人IgG結(jié)合物（SAHIgG—HRP)的制備：按過碘酸鹽改良法，略加改進(jìn)標(biāo)記制成酶標(biāo)抗體。即HRP8.0ml，22℃較攪20min。加乙二醇6滴，繼續(xù)攪拌5min，對pH4.2，0.001mol/L醋酸鹽緩沖液（用2molHC1調(diào)pH)透析過夜，中間換水4次，加羊抗人IgG（上海生物制品研究所產(chǎn)品)14mg，逐滴加pH，1.0mol碳酸鹽緩沖液，使pH升到9.0～9.5，室溫較攪2h，加硼氫化鈉（4mg/ml)0.2ml，置4℃2h，對pH7.2，0.01molPB－0.4molNaCl緩沖液在4℃透析平衡。換水4次，收取透析袋內(nèi)結(jié)合物，以50％飽和度硫酸銨溶液鹽析去除游離酶后，測定精制結(jié)合物，E/P克分子比值合格后，將結(jié)合物小瓶分裝置－20℃保存，備用。⑨尿素酶測定法和Hp的分離培養(yǎng)法參考文獻(xiàn)進(jìn)行。

1.2　方法

并稍加改進(jìn)，即：抗原包被微量滴定板：用包被液將抗原按2×10⁸億/ml（含蛋白8.6μg)稀釋后，每孔加100μ，離心籃離心20min2000r/min后，倒去孔內(nèi)液體，然后加入0.25％戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗滌液洗3次（每次3min)，加5％小牛血清液，200ml/孔，經(jīng)37℃30min封板后倒去孔內(nèi)液體。每孔加待檢血清(1：100稀釋)100ml，37℃保溫1h后，如上洗滌3次，同時(shí)做陰性對照孔和空白孔。之后于各孔內(nèi)加和新鮮稀釋的酶標(biāo)羊抗人IgG結(jié)合物100ml，37℃保溫半小時(shí)，于各孔中加入2NH₂SO₄50μl終止反應(yīng)后，于酶聯(lián)測定儀以波長490nm測定OD值，將測得標(biāo)本OD值（P)與陰性對照OD值（N)比（P/N)，若P/N比大于或等于2.0為陽性。

2　結(jié)果

2.1　ELISA的建立

為了知道所制備的SAHIgG－HRP在是接ELISA中的活性（結(jié)合第一抗體，效價(jià))，將此酶標(biāo)抗體稀釋成1：16000，1：32000，1：64000，1：128000，1：256000，1：512000六種濃度，將作第一抗體的已知病人Hp感染陽性血清稀釋成1：100包被微板的Hp抗原濃度為2×108mg/ml，按上述步驟和主法進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。結(jié)果表明，所標(biāo)記的羊抗人IgG酶標(biāo)抗體當(dāng)稀釋度為1：32000～1：512000時(shí)，它們的P/N值均為≥2.0，因此，了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定采用個(gè)單位效價(jià)，即用1：256,000稀釋度作正式實(shí)驗(yàn)（注1：512000為一個(gè)效價(jià)單位)。

為了解Hp抗原在包被微量滴定板中最適濃度，將Hp抗原用抗原包被液分別按蛋白濃度稀釋成0.27，0.54，1.08，2.15，4.3，www.gydjdsj.org.cn8.6，17.2及34.4μg/ml8種濃度，然后分別進(jìn)行包被，與第一抗體陽性血清(1：100)和SAHIgG—HRP(1：256000)按上述步驟和方法進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。結(jié)果，當(dāng)Hp抗原濃度為8.6～17.2％μg/ml時(shí)OD值最高，Hp抗原在34.4μg/ml時(shí)，OD值下降，因此Hp抗原包被量最適濃度為.8.6～17.2μg/ml。以后實(shí)驗(yàn)用此抗原濃度包板。

為了確定用ELISA測定病人抗Hp抗體的陽性血清濃度，用Hp抗原8.6μg包板，SAHIgG—HRP仍用二個(gè)單位（1：256000)，將二份陽性血清混后后稀釋成1：50，1：100，1：200，1：400和1：800五種濃度進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，測定OD值的結(jié)果。結(jié)果顯示陽性血清稀釋度與OD值呈較好的線性關(guān)系，當(dāng)血清稀釋度為1：50時(shí)OD值為1.521，1：100時(shí)OD值是1.172，P/N比值均大于2.0，故以后實(shí)驗(yàn)中第一抗體的血清濃度均用1：100的稀釋度。

為了驗(yàn)證ELISA間接法用于檢測Hp抗體的特異性，進(jìn)行特異性吸收試驗(yàn)。選用8份Hp感染性血清以1：50稀釋，加等量Hp菌懸液，混勻置37℃半小時(shí)，再置4℃過夜吸收后離心取上清液按上述實(shí)驗(yàn)條件和方法進(jìn)行ELISA測定，結(jié)果見表1。

表1　特異吸收抑制試驗(yàn)結(jié)果

從表1結(jié)果可知，陽生血清經(jīng)吸收1次后，OD值均較吸收前下降，特別8號血清前后相比下降了50％，由此均顯示特異吸收抑制試驗(yàn)陽性，證明該8份陽性血清的抗Hp抗體是特異的。為了探索所建立的ELISA間接法檢測抗Hp抗體的敏感度，選擇6份抗p陽性血清按上述實(shí)驗(yàn)條及方法進(jìn)行ELISA檢測，同時(shí)與試管凝集試驗(yàn)和顯微凝集試驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

表2　ELISA測定Hp抗體敏感比較結(jié)果

數(shù)字為稀釋倍數(shù)的倒數(shù)

從表2結(jié)果表明，6份抗Hp抗體陽性血清用所建立的ELISA間接法測出的抗體效價(jià)均＞1：800，試管凝集試驗(yàn)測出的抗Hp抗體效價(jià)為1：160～1：640，顯微凝集試驗(yàn)測出的抗Hp抗體效價(jià)為1：160～1：320，顯然ELISA法比后兩者方法敏感的多。

批內(nèi)誤差　將4份陽性血清標(biāo)本在同一塊板上按上述方法重復(fù)進(jìn)行9次ELISA試驗(yàn)，計(jì)算各份標(biāo)本檢測OD值結(jié)果的變異系數(shù)（表3)。

表3　4份陽性血清重復(fù)9次ELISA檢測(x)

從表3得知，批內(nèi)誤差范圍是5.5％～8.1％，平均6.87％，顯示按上述實(shí)驗(yàn)條件建立的檢測Hp抗體的間接法ELISA的穩(wěn)定性好，重復(fù)性佳。

批間誤差　將5份陽生血清，按上述方法及實(shí)條件在1W內(nèi)反復(fù)進(jìn)行3次ELISA，計(jì)算各份標(biāo)本檢測OD值結(jié)果的變異系數(shù)（表4)。結(jié)果指出三批陽性標(biāo)本的變異系數(shù)在0.74％～8.12％之間，平均4.67％，由此亦顯示按上述實(shí)條件建立的檢測Hp抗體的間接法ELISA重復(fù)性和穩(wěn)定性均良好。

2.2　臨床標(biāo)本檢測結(jié)果

將胃鏡檢查患者的血清以1：100稀釋，用上述實(shí)驗(yàn)條件建立的ELISA間接法進(jìn)行，Hp抗體（ELISA－HpAb)檢測，同時(shí)將同一患者胃粘膜進(jìn)行Hp分離培養(yǎng)（HpC)和Hp尿素酶測定（HpUT)，以資比較（表5)。

表4　5份陽性血清標(biāo)本進(jìn)行ELISA的批間誤差試驗(yàn)結(jié)果

表5　ELISA法培養(yǎng)法和尿素酶法對比

表5結(jié)果指出，ELISA－HpAb法的陽性數(shù)為34/38（89.4％)，Hp培養(yǎng)法的陽性數(shù)23/38（60.5％)，HpUT法的陽性數(shù)為22/38（57.9％)，表明ELISA－HpAb法敏感性較另二法都高（ELISA與CP培養(yǎng)法比較X²＝8.94，P＜0.01。ELISA－HpAb與HpUT比較X²＝9.77，P＜0.01。)38例患者用ELISA－HpAb法與培養(yǎng)法（HpC)和HpUT法結(jié)果符合率比較，結(jié)果見表6及表7。

表6　ELISA－HpAb法與HpC法符合率比較

表7　ELISA－HpAb法與HpUT法符合率比較

表6及表7比較結(jié)果表明，ELISA－HpAb與HpC法的總符合率為65.80，與HCPUT法總符合率為68.4％。在ELISA－HpAb法的34例陽性中HpC法和HpUT法的23例及22例陽性中，ELISA－HpAb法只有一例未檢出，由此均表明，ELISA－HpAb法比HpUT法敏感。

3　討論

關(guān)于診斷Hp病的血清學(xué)方法，至目前為止主要有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，被動血凝集試驗(yàn)，細(xì)菌凝集試驗(yàn)等法。但由于這些方法操作繁鎖，或敏感性低，或可靠性欠佳，故現(xiàn)已較少采用。自ELISA法建立以來，證明具有敏感性高，穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，國外報(bào)道已有人用此法來檢測人血清中抗Hp抗體，也證實(shí)特異、敏感。但國內(nèi)尚未有報(bào)道證實(shí)此法能否用于Hp抗體的檢測和診斷Hp感染。本文報(bào)道所建立的檢測Hp抗體的間接ELISA法實(shí)驗(yàn)和初步用于臨床標(biāo)本檢測結(jié)果證實(shí)具有較好的特異性，敏感性（比試管凝集和顯微凝集試驗(yàn)敏感＜2～3倍)和重復(fù)性。為快速診斷Hp提供較好的方法（表1～7)。然而其中操作步驟除按文獻(xiàn)報(bào)道的一般流程（Hp抗原包被微板→甲醛固定→封閉（牛血清白蛋白)→人Hp抗體溫育→羊抗人IgG酶標(biāo)抗體溫育→底物顯色→酶聯(lián)測定儀測定)外，作了若干改進(jìn)：①Hp抗原的制備：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告，抗原的制備有超聲粉碎，福爾馬林固定處理等方法。但Goodwin等認(rèn)為經(jīng)過鹽酸—甘氨酸制成的可溶性抗原應(yīng)用于ELISA更加可靠。本文采用抗原是經(jīng)過福爾馬林殺死和固定，用PBS洗三次，置冰箱反復(fù)凍融3次后制成的Hp抗原，用蛋白濃度為8.6μg/ml包被微板亦可獲得滿意結(jié)果。②通過2000r/min，20min離心沉淀，戊二醛合固定30min的抗原代替過夜包被同樣得到滿意結(jié)果。③檢測血清標(biāo)本陽性的稀釋度（陽性www.med126.com滴度或陽性單位)：Goodwin等的報(bào)告，用ELISA檢測病人血清抗Hp抗體的滴度認(rèn)為在＞1：300（或＞300EU)與Hp的胃疾患非常接近。本文通過選擇10歲以下兒童血清作正常對照和已知Hp陽性血清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，根據(jù)P/N≥2的判定陽性標(biāo)準(zhǔn)原則結(jié)果表明以1：100以上（或＞100EU)作為陽性血清標(biāo)本6份滴度較高的與試管凝集和顯微凝集試驗(yàn)對比測定，結(jié)果表明，在后二者方法中，均有1：320的抗Hp抗體（表2)。由此也證明用兒童血清作正常對照用用此判斷陽性標(biāo)準(zhǔn)是可靠的；同時(shí)證實(shí)這些病人血清中確實(shí)有較高抗Hp抗體。但是，此等判定陽性標(biāo)準(zhǔn)是否非常合適還待進(jìn)一步實(shí)踐證實(shí)。

ELISA－HpAb法與HpC法和HpUT法的結(jié)果比較，前者比后二者的陽性數(shù)高（89.4％)，符合率分別是65.8％和68.4％（表5)。但常規(guī)培養(yǎng)法需時(shí)3d～7d，HpUT法較快速，但受活檢粘膜內(nèi)菌量多少及取材部位影響較大，短暫停留在胃內(nèi)的腸道菌易造成假陽性結(jié)果。因此特異性不如ELISA－HpAb法。但是，ELISA－HpAb法與HpC和HpUT法檢出的陽性病例數(shù)與胃鏡檢查的診斷和病理診斷是否完全相符，有待進(jìn)一步的研究和分析。