1 毒種
1.1毒種來源
可用Sabin株，Sabin純化株，中Ⅱ17，中Ⅲ2株。所有疫苗生產(chǎn)用毒株均須經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)。
1.2 毒種批
1.2.1 毒種批制備與保存
毒種批用原毒株在猴腎細(xì)胞或人二倍體細(xì)胞上制備。從原毒株算起，SabinⅠ、Ⅱ型、中Ⅱ17及中Ⅲ2型傳代次數(shù)均不得超過3代，SabinⅢ型不超過2代。所有毒種均應(yīng)于-60℃以下保存。
1.2.2 毒種批檢定
每一毒種批均按A3項(xiàng)分批檢定（滴度不得低于6.5LogPFU/1.0ml)。
2 疫苗制備
生產(chǎn)用房應(yīng)為獨(dú)立的單元，不得攜入或操作強(qiáng)毒株或其他病毒、致病菌。生產(chǎn)前，應(yīng)對生產(chǎn)區(qū)進(jìn)行消毒。
工作人員必須經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，身體健康，并服用脊髓灰質(zhì)炎活疫苗。每年生產(chǎn)前應(yīng)進(jìn)行體檢。傳染性肝炎、痢疾、活動性肺結(jié)核患者不得進(jìn)入生產(chǎn)部門。在猴區(qū)工作的人員不得患有肺結(jié)核。
2.1 猴腎細(xì)胞制備
2.1.1 動物選擇和檢疫
用未做過其他試驗(yàn)或做過本疫苗檢定的健康獼猴制備細(xì)胞培養(yǎng)物。所用動物隔離檢疫應(yīng)不少于6周，應(yīng)無結(jié)核、B病毒感染及其他急性傳染病。凡有嚴(yán)重化膿灶、贅生物以及明顯的肝、腎病理改變者不得用于制備疫苗。
2.1.2 細(xì)胞消化與培養(yǎng)
采用電磁攪拌或灌注法以胰蛋白酶或其他分散劑消化猴腎細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)瓶置37±0.5℃培養(yǎng)，應(yīng)于9天內(nèi)長成單層。每只猴所獲細(xì)胞為一個細(xì)胞批。
可把原代猴腎細(xì)胞連續(xù)傳5代后www.med126.com，用于接種病毒。
2.2 病毒接種、培育與收集
細(xì)胞維持液含3.0～5.0g/L碳酸氫鈉（pH7.6～7.8)。病毒接種量為0.01～0.5MOI，種毒后置33±0.5℃培養(yǎng)，出現(xiàn)完全病變時間應(yīng)在40～96小時。
病毒液按細(xì)胞批收集于大瓶中，澄清過濾。
2.3 病毒液合并或濃縮
病毒液合并或濃縮時可用0.2μm的濾膜過濾。
2.4 加氯化鎂與分批
病毒液加氯化鎂，最終濃度為1mol/L（pH6.8～7.2)即為液體疫 苗。
同日制備的病毒液為一個亞批，數(shù)個亞批組成一個疫苗批，批量一般不超過40萬ml。
2.5 分裝
半成品經(jīng)檢定合格后分裝即為液體疫苗成品。
3 檢定
3.1 猴腎細(xì)胞外源因子檢查
3.1.1 對照細(xì)胞檢查
于接種病毒當(dāng)天（0天)，每批猴腎細(xì)胞留取10%～25%換維持液，作為正常細(xì)胞對照，以檢查外源因子。
該細(xì)胞瓶置33～35℃培育，觀察14天，以此期間檢查細(xì)胞病變。有疑似病毒存在者，用猴腎細(xì)胞傳代，傳代后仍有類似現(xiàn)象，該細(xì)胞批所制疫苗應(yīng)廢棄。用于傳代的猴腎細(xì)胞應(yīng)設(shè)細(xì)胞對照。
3.1.2 血吸附檢查
種毒后7天，檢查對照細(xì)胞中血吸附病毒。通常用0.2%～0.5%雞、豚鼠紅細(xì)胞（儲存于2～8℃不超過7天)，分別放4～8℃、20～25℃30分鐘觀察結(jié)果，應(yīng)為陰性。如血吸附可疑陽性，在同種細(xì)胞上繼續(xù)盲傳，如傳出病毒，該批細(xì)胞制備的疫苗應(yīng)予廢棄。
3.1.3SV40及其他外源因子檢查
當(dāng)日生產(chǎn)猴腎細(xì)胞批同時接種小方瓶數(shù)個做外源因子檢查，于種毒0～2天，將細(xì)胞上清混合液接種于對SV40病毒敏感的Vero細(xì)胞瓶中，混合液在培養(yǎng)液中的含量應(yīng)不少于20%，同種細(xì)胞最少留一瓶以上不接種，作為細(xì)胞對照，觀察14天。于接種后5～8天，再把上述細(xì)胞培養(yǎng)的上清液盲傳一代，傳代后觀察14天。
3.2 病毒液檢查
3.2.1 外源因子檢查
樣品以脊髓灰質(zhì)炎病毒型特異性抗體（該抗體不能用猴制備，免疫用抗原必須用非靈長類細(xì)胞制備)或單克隆抗體中和。中和物（可稀釋，但稀釋度不應(yīng)超過1∶4)接種猴腎細(xì)胞或其他已知對SV40敏感的細(xì)胞，并留取正常細(xì)胞對照，37℃培養(yǎng)觀察4周。觀察到2周時，用同樣細(xì)胞再傳一代，并觀察2周。觀察期滿因其他原因剔除不能觀察的細(xì)胞瓶數(shù)不大于20%，本試驗(yàn)為成立。如培養(yǎng)物發(fā)生病變，應(yīng)查清原因。如證實(shí)該病變是由于未中和的脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的則須重試。如證實(shí)病變確系SV40或其他外源因子污染所致，并證明與病毒液有關(guān)，則該批病毒液應(yīng)廢棄。
3.2.2 無菌試驗(yàn)及支原體檢查
按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。支原體檢查使用已證實(shí)支持需固醇和非需固醇支原體生長的液體和固體兩種培養(yǎng)基。
3.2.3 病毒滴定
用微量細(xì)胞病變法或空斑法在猴腎或Hep-2或其他敏感細(xì)胞上進(jìn)行。培養(yǎng)溫度為35～36℃，病變法7天判定結(jié)果，空斑法4天判定結(jié)果。病毒滴定時應(yīng)設(shè)病毒參考品。
3.2.4型特異性檢定
�、瘛ⅱ�、Ⅲ型單價或三價脊髓灰質(zhì)炎病毒抗血清與等量樣品混合，置37℃中和1小時，接種猴腎、Hep-2或其他敏感細(xì)胞，7天判定結(jié)果。樣品應(yīng)為單價病毒液，型別正確無誤。
3.2.5 家兔試驗(yàn)
經(jīng)3.2.1～3.2.4項(xiàng)檢定合格的樣品，每瓶等量取樣合并。如果不立即進(jìn)行檢定，樣品應(yīng)保存于-20℃以下。
樣品應(yīng)進(jìn)行獼猴皰疹病毒（B病毒)和其他病毒檢查。用體重為1.5～2.5kg的健康家兔最少5只，每只家兔注射的樣品量不少于10ml，用其中1ml進(jìn)行皮內(nèi)多點(diǎn)注射，其余的進(jìn)行皮下注射，觀察時間不少于3周。到期動物死亡數(shù)不得超過20%。無B病毒和其他病毒感染判為合格。
家兔在試驗(yàn)24小時以后死亡，疑有B病毒感染時作尸體解剖檢查，取部分神經(jīng)組織及臟器標(biāo)本凍存待查。同時用腦細(xì)胞制成10%懸液，以同樣方法接種5只家兔，證實(shí)有B病毒感染時，應(yīng)終止生產(chǎn)并報告國家檢定當(dāng)局，未采取措施防止再感染之前，不得繼續(xù)生產(chǎn)。
3.2.6猴體試驗(yàn)
猴體神經(jīng)毒力試驗(yàn)可采用脊髓注射或腦內(nèi)注射方法。應(yīng)使用健康獼猴，體重在1.5kg以上并應(yīng)符合2.1.1項(xiàng)規(guī)定。猴血清經(jīng)1∶4稀釋后應(yīng)證明不含同型病毒中和抗體。
3.2.6.1 脊髓法
（1)猴的數(shù)量
疫苗猴體試驗(yàn)必須設(shè)立參考制品。評價Ⅰ、Ⅱ型疫苗及其參考制品最少應(yīng)各有11只有效猴，評價Ⅲ型疫苗應(yīng)至少有18只有效猴。數(shù)個亞批疫苗可合并作一個疫苗批進(jìn)行猴體試驗(yàn)，疫苗量一般不超過40萬ml。猴子的大小和性別應(yīng)承受機(jī)分配各組。同型參考制品可用于測試一批以上疫苗。
有效猴系指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)看到脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的特異性神經(jīng)元損傷的猴子。
有效猴數(shù)不足時，允許補(bǔ)足，但也應(yīng)同時設(shè)有參考猴數(shù)。如試驗(yàn)需要2個工作日，則每一個工作日用疫苗和同型參考制品接種的猴子數(shù)應(yīng)相等。為了得到11只和18只有效猴，通常要相應(yīng)地增加接種猴數(shù)。
（2)疫苗和參考制品的病毒滴度
疫苗和同型參考制品的病毒含量應(yīng)調(diào)整到盡可能接近，每只猴注射6.5～7.5LogCCID50/1.0ml，但只用一個病毒濃度接種動物。
（3)試驗(yàn)觀察
全部猴子應(yīng)觀察17～22天。在接種24小時后死亡猴應(yīng)作尸體解剖，檢查是否因脊髓灰質(zhì)炎引起的死亡。因其他原因死亡的猴子在判定時可以剔除。
在觀察期內(nèi)死亡的猴數(shù)不超過20%時，試驗(yàn)為成立。
呈瀕死狀態(tài)或嚴(yán)重麻痹的猴子應(yīng)處死進(jìn)行尸檢。
（4)檢查切片數(shù)
每只猴子取中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行組織學(xué)檢查。切片厚度為10～15μm，沒食子藍(lán)染色檢查切片數(shù)如下：
腰膨大12個切面；
頸膨大10個切面；
延髓2個切面；
橋腦和小腦各1個切面；
中腦1個切面；
大腦皮層左右側(cè)和丘腦各1個切面。
（5)病毒活性的計(jì)分
為了評價腦和脊髓半個切面的病毒活性，由同一人員統(tǒng)一采用4級計(jì)分法判斷其病變嚴(yán)重程度。
（一)僅有細(xì)胞浸潤（這不足以認(rèn)為是有效猴)；
（二)細(xì)胞浸潤伴有少量的神經(jīng)元損害；
（三)細(xì)胞浸潤伴有廣泛的神經(jīng)元損害；
（四)大量的神經(jīng)元損害，伴有或無細(xì)胞浸潤。
切片中有神經(jīng)元損害，但未見針跡者應(yīng)視為有效猴。切片中由外傷引起的損害，而又無特異的病理改變則不視為有效猴。
嚴(yán)重程度的分值是由腰髓、頸髓和腦組織切片的整個切片的計(jì)分累計(jì)而成的。每只有效猴的病變分值為：
Ls=〔腰髓分值總和/半個切片數(shù)+頸髓分值總和/半個切片數(shù)+腦分值總和/半個切片數(shù)〕÷3
再計(jì)算每組有效猴的平均分值。
（6)神經(jīng)毒力試驗(yàn)的評價。
參考制品的平均病變分值在上限與下限之間時，各生產(chǎn)單位才能根據(jù)各自的C1、C2、C3值判定疫苗合格與否，判定標(biāo)準(zhǔn)如下：
疫苗的平均病變分值（Xtest)與參考制品的平均病變分值（Xref)想比較。
合格：Xtest-Xref＜C1
不合格：Xtest-xref＞C2
重試：（1)C1＜Xrest-Xref＜C2（僅限一次)；
（2)同一次試驗(yàn)中，疫苗組平均分值與參考組平均分值之差小于C1時，而疫苗組中單只猴最高分值≥2.5，并大于疫苗參考組單只猴最高分值的兩倍時，本批疫苗應(yīng)重試。
重試合格：[X（test1+test2)-X（ref1+ref2)]/2＜C3
重試不合格：[X（test1+test2)-X（ref1+ref2)]/2＞C3
3.2.6.2 腦內(nèi)法
取健康猴20只，麻醉后在兩側(cè)視丘分別注入0.5ml樣品，不低于 7.0LogPFU/1.0ml及10-1各10只，觀察21天。到期動物死亡數(shù)和未命中數(shù)不得超過20%，否則應(yīng)補(bǔ)足。注射后48小時內(nèi)死亡或出現(xiàn)非特異性麻痹癥狀者剔除不計(jì)。中途死亡及到期處死動物，做中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理組織學(xué)檢查，判定標(biāo)準(zhǔn)如下：
合格標(biāo)準(zhǔn)：凡符合下列情況之一判為合格：
（1)中樞神經(jīng)系統(tǒng)無脊髓灰質(zhì)炎病理組織學(xué)改變；
（2)有2只猴發(fā)生輕度及其以下病變；
（3)1只猴發(fā)生中度及其以下病變。
不合格標(biāo)準(zhǔn)：
（1)一只猴有中度病變，同時一只猴有輕度以上病變者；
（2)一只猴有重度以上病變者。
重試標(biāo)準(zhǔn)：
2個亞批疫苗合并試驗(yàn)結(jié)果不合格者，可以分批重試，并按上述標(biāo)準(zhǔn)判定。
3.2.7rct特征試驗(yàn)
將單價病毒液分別在36℃及40℃溫度條件下進(jìn)行病毒滴定，培養(yǎng)溫度差不超過±0.1℃，試驗(yàn)設(shè)t+和t-樣品（生產(chǎn)毒種或已知對人安全的疫苗)為對照。如果被試病毒液和參考病gydjdsj.org.cn/wsj/毒在36℃的繁殖滴度比40℃的滴度高5.0Log，則rct特征試驗(yàn)合格。此外，也可進(jìn)行d特征試驗(yàn)，以彌補(bǔ)rct特征試驗(yàn)的不足。
3.3 成品檢定
3.3.1 外觀檢查
疫苗應(yīng)為橘紅色液體，澄清無異物。
3.3.2 無菌試驗(yàn)
按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
3.3.3 病毒滴定
與3.2.3項(xiàng)相同。每人份三價疫苗病毒含量（LogCCID50或PFU/1.0ml)應(yīng)≥6.15,Ⅰ型6.0，Ⅱ型5.0，Ⅲ型5.5。單價應(yīng)≥5.0。
3.3.4 熱穩(wěn)性定試驗(yàn)
疫苗批樣品于37℃放置48小時，病毒滴度降低不得超過0.5Log。
4 保存與效期
于-20℃以下保存，自病毒滴定合格之日起效期為2年。2～8℃保存效期為1年。
