實驗動物科學:第一節(jié)　無菌動物

一、無菌動物的基本概念

所謂無菌動物，就是指不能檢出任何活的微生物和寄生蟲的動物。從微生物學的觀點看，通常實驗動物的體內(nèi)和體外帶有寄生蟲，體內(nèi)還常帶有細菌和病毒，而且還都難于排除某些潛在的傳染病。此外，普通實驗動物的血清中含有抗體。所以用并存普通動物進行醫(yī)學科學研究，將會存在各種各樣的干擾，實驗結果往往不確切。使用無菌動物作實驗就可以克服普通實驗所存在缺點，使實驗結果正確可靠。

無菌動物是在無菌屏障系統(tǒng)中，剖腹取出胎兒，飼養(yǎng)繁育在無菌隔離器中，飼料、飲水經(jīng)過消毒，定期檢驗，證明動物體內(nèi)外均無一切微生物和寄生蟲（包括大部分病毒)的動物。無菌動物的“菌”主要是指細菌，而嚴格來說，還包括真菌、立克次氏體、支原體和病毒等微生物及各種寄生蟲。而所謂“無”卻不是絕對的，不過是根據(jù)現(xiàn)有的科學知識和檢查方法在一定時期內(nèi)不能檢出已知的微生物和寄生蟲而已。隨著科學技術的發(fā)展，現(xiàn)在認為是無菌的動物或許將來可以檢出微生物和寄生蟲而不是無菌動物，因為這個“無”是相對而言的。到目前為至，尚未確立無菌動物的微生物檢定法，因此，研究者的檢定方法各式各樣，其中病毒和立克氏體的檢查尚有相當多的問題。例如，在無菌動物中供實驗室使用最多的無菌小鼠，用電子顯微鏡檢查證明，胸腺細胞中仍有存在白血病病毒的例子，因而，現(xiàn)在的所謂無菌動物，指動物體內(nèi)外未能檢出細菌、真菌、原蟲、內(nèi)外寄生蟲的動物較妥當。

用大量抗菌素也可以使普通動物暫時無菌，但是這種動物不是無菌動物。因為這種無菌狀態(tài)往往是一過性的，某些殘存的細菌在適當?shù)臈l件下又會在體內(nèi)增殖；即使能把體內(nèi)細菌全部殺死，它們給動物造成的影響卻是無法消除的，例如：特異性抗體的存在、網(wǎng)狀內(nèi)皮膚系統(tǒng)的活化、某些組織或器官的病理變化等。因此，無菌動物必須是生來就無菌的動物。

按對微生物的控制的程度，可以將實驗動物分為四類：即（１)無菌動物（Germ　Free,GF)；（２)悉生動物或已知菌動物（Gnotobiotics,GN)；（３)無特定病原體動物（Specific　Pathogen　Free,SPF)；（４)通常動物（Conventional,CV)。無菌動物和悉生動物飼養(yǎng)于隔離器中（隔離系統(tǒng))，無特殊病原體動物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)，通常動物飼養(yǎng)于開放系統(tǒng)。

通常動物是在開放系統(tǒng)條件下飼養(yǎng)的，都受到自然界微生物和寄生蟲的侵襲，一般都帶細菌、病毒和寄生蟲。有的動物外觀看起來健康，其實都隱藏著某些疾病或有微生物與寄生蟲的感染。因此用通常動物進行實驗敏感性差、反應性不一致，實驗結果缺乏再現(xiàn)性。要提高動物實驗的準確性，就必須對實驗動物在遺傳和微生物兩個方面加以控制，培養(yǎng)出標準的合格動物，才能使實驗結果正確可靠，達到反應均一性和重復性。采用兄妹間近親交配殖繁20代以上所培育的近交系動物，遺傳均一、個體差異小、實驗結果比較準確。但是只從遺傳上加以控制，如不進行微生物控制，沒有排除自然感染的微生物和寄生蟲的影響，實驗結果仍可能不準確。因此，在精度要求高的實驗中，無菌動物、悉生動物和無特殊病原體動物就成了理想的實驗動物。

表6－1　按微生物控制程度的實驗動物分類原則

二、無菌動物的發(fā)展

無菌動物的產(chǎn)生和發(fā)展，已有近百年的歷史，許多學者曾對肖椎動物和脊椎動物的無菌狀態(tài)進行過反復的研究。無菌動物的研究，起源于19世紀后期，1885-1886年間，確立了在動物體內(nèi)沒有微生物也能生存的概念。1885年，Dudeaux曾將豌豆在無菌條件下進行栽培，證明無菌植物不能利用供給的養(yǎng)分。同年Pasteur認為，動物在沒有腸道細菌參與條件下不能生存。1886年Neucki提出相反的看法，認為細菌對于動物的生存不是必需的。因此展開了一場爭論。約10年后，1895年Kijanizin在無菌代謝試驗籠內(nèi)飼養(yǎng)兔，給予無菌空氣、飼料和水，兔的體重逐漸下降，并因負氮平衡而死亡。同年Nuttall和Thierfelder經(jīng)剖腹產(chǎn)獲得豚鼠，飼養(yǎng)于玻璃罩內(nèi)，每小時人工哺以滅菌牛奶和純動物性飼料一次，共計8天，動物外觀健康，將此動物于第8天處死，其腸內(nèi)容物沒有檢出細菌。1914年Cohendy也曾飼養(yǎng)過無菌豚鼠，但是沒有獲得成功。14年后Glimstedt繼續(xù)開展無菌豚鼠的研究，于1932年，終于把無菌豚鼠養(yǎng)活兩個月，取得了初步進展，至1959年Teah在Notre　Dame大學已能使無菌豚鼠繁殖。

關于無菌雞的培育，早在1897年Schottelius就曾獲得，但沒有繼續(xù)養(yǎng)活。1908年Cohendy育成無菌雞，且生長情況良好。1935年Kimura，Naito和Kobayashi在日本京都大學飼養(yǎng)了無菌雞。1944年Luckey和Lakey又開始進行無菌雞飼料營養(yǎng)的研究。1948年美國Lobund小組飼養(yǎng)的無菌雞，成長后第一次產(chǎn)卵，并孵化出新的一代，從此飼養(yǎng)無菌雞獲得完全的成功。

由于1922年Baeot和Harden發(fā)現(xiàn)無菌蠅蛆必須飼喂B族維生素才能正常生長，證明了無菌動物對B族維生素的需要，因為無菌動物腸內(nèi)沒有細菌存在，自身不能合成B族維生素，從而找到了過去的飼養(yǎng)無菌動物失敗的原因。1937年Balzam在無菌雞的維生素B族缺乏癥及在雞體內(nèi)能否合成B族維生素的研究中，更加清楚地證明了這個問題。無菌動物對B族維生素需要的發(fā)現(xiàn)是很有價值的，它推動了無菌動物培養(yǎng)工作的發(fā)展，并使之走向成功。

第一個無菌大白鼠群是美國Lobund小組于1951年建立的。第二個無菌大白鼠群是Gustafsson于1956年在瑞典建成。1959年Reyniers在Tempa大學建立無菌動物實驗室。印度的無菌動物群于1959年在印度大學醫(yī)學中心建立。

隨著無菌動物研究的開展，無菌動物的飼養(yǎng)裝置也不斷地改進。1915年德國的科斯特首次創(chuàng)造無菌動物培育隔離器。1928年美國圣母大學細菌學實驗室的Reyniers創(chuàng)造了不銹鋼制的無菌動物大型隔離器。從此開展了無菌動物的系統(tǒng)實驗。現(xiàn)在美國有48個無菌動物研究單位，僅國立衛(wèi)生研究院的5個研究所里，就分別設有無菌動物研究室。1930年Gustafsson設計了第二型隔離器，整個隔離器的原料是不銹鋼的。在日本，自1946年開始培育無菌動物，1959年宮川用不銹鋼做隔離器的主體部分，并附有小的玻璃觀察窗和靈敏的機械手，使不銹鋼隔離器達到比較完善的地步。但這種隔離器既笨重造價又昂貴，不可能大量推廣使用，因而也限制了無菌動物工作的開展。在日本現(xiàn)有24個單位從事無菌動物研究工作，僅在東京就有9個無菌動物研究單位。50年代，發(fā)明了用過氧乙酸進行表面滅菌的方法以后，1957年P.C.Trexler在美國印第安那州圣母大學Lobund研究室里創(chuàng)造了塑料膜隔離器，用無毒聚氯乙烯薄膜制造隔離器的主體部分。由于這類隔離器制作方便，既輕便又實用，所需用費用又不高，僅為不銹鋼隔離器的幾十分之一，滅菌方法也大為簡便，因此日漸廣泛地得到應用，促進了無菌動物研究的發(fā)展。

1978年Lobund研究室的Morris　Pollard博士來華講學時給我國贈送了一具Trexler隔離器，中國醫(yī)科院動物中心已仿制成功，上海、蘇州等地也已制作成功，并已小批量生產(chǎn)。近二年來，Trexler教授親自來華講學，傳授隔離器和無菌動物飼養(yǎng)繁殖技術，促進了我國無菌動物研究的發(fā)展�，F(xiàn)在北京、上海等地已有幾個單位在研究無菌動物。

此外，澳大利亞、比利時、西德、蘇聯(lián)、捷克、英國、法國、意大利等國和地區(qū)，都已建立了包括無菌動物在內(nèi)的實驗動物中心。

對無菌動物的研究最初只是為了探討高等動物與體內(nèi)微生物之間的關系。19世紀末,Nattal氏及Thierfelder氏用剖腹術取出了妊娠豚鼠的胎兒，在無菌環(huán)境下飼養(yǎng)了10天。隨后，Schettelus發(fā)現(xiàn)雞的胚胎是無菌的，后來成功地進行了雛雞的無菌化。無菌動物所具有的獨特優(yōu)越性使其成為一種新型的實驗動物。隨著生物學的進步和技術的發(fā)展，試行了各種動物的無菌化，現(xiàn)在無菌動物的品種已經(jīng)很多，不僅小鼠、大鼠、豚鼠和家兔等小動物已有無菌動物，而且狗、貓、猴、豬、山羊、綿羊和牛等大動物以及雞、火雞、鵪鶉、青蛙、蛇甚至蠶、蒼蠅、白蟻等也都有了無菌動物。這些都是為了適應科學發(fā)展的需要而培育的，其中的小鼠、大鼠、豚鼠，國外一些發(fā)達國家已能大量生產(chǎn)，并比較方便地應用于日常研究中了。已育成的無菌動物見表6-2。

表6-2　已育成的無菌動物

三、無菌動物的特征

只要飼料配備適當，無菌動物發(fā)育正常，外觀和普通動物相同，但是其機能、結構和普通動物有很大的不同。無菌動物受兩個因素影響，即微生物和因飼養(yǎng)比較聚集而致的腎上腺增大。

無菌動物的特征主要反映在下面二個方面

（一)形態(tài)學改變

1．消化系統(tǒng)：主要變化在腸道

⑴無菌動物腸道肌層薄，更為特異的是盲腸肥大，比普通動物要大5-6倍。無菌豚鼠的盲腸可達體重的1/3。主要是由于腸壁薄、張力低而增大。由于盲腸膨大，腸壁菲薄，常因盲腸扭轉(zhuǎn)或腸壁破裂而死亡。如給無菌動物注入梭狀芽孢桿菌則可縮小盲腸體積。

⑵腸粘膜絨毛增多。

⑶肝臟重量下降。

2．循環(huán)系統(tǒng)：心臟相對縮小。

3．血液系統(tǒng)：白細胞增加。普通動物白細胞總數(shù)波動范圍大，無菌動物白細胞數(shù)值恒定。

4．網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)：脾臟縮小，無三級濾泡，網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞功能降低。

（二)生理學改變

1．免疫功能：由于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、淋巴組織發(fā)育不良，淋巴小結內(nèi)缺乏生發(fā)中心，產(chǎn)生丙種球蛋白的能力很弱（在檢查無菌動物的無菌性時，血清丙種球蛋白陰性可以作為無菌的一個輔助證據(jù))，又因為體內(nèi)無微生物和寄生蟲，血中無抗體，血清殺菌力低，吞噬細胞噬菌力也低，因此對微生物感染異常敏感，某些病原性弱和必須經(jīng)腹腔或顱腦接種才能感染普通動物的微生物很容易感染無菌動物。

2．生長率：無菌條件下對不同種屬影響不同。無菌鳥類生長率高于同種的普通鳥類；無菌大小鼠與普通鼠差不多；無菌豚鼠和無菌兔生長率比普通者慢。因腸內(nèi)無菌，不能幫助消化纖維素以提供機體所需要的營養(yǎng)。

3．生殖：無菌條件對動物的生殖影響不大。大鼠和小鼠因出生無感染身體較好；無菌豚鼠及兔比普通者繁殖力低，可能因大盲腸之故。

4．代謝：血中含氮量少，腸管對水的吸收率低，代謝周期比普通動物長。

5．營養(yǎng)：與動物品種有關，豚鼠和兔的腸道長，故有影響。無菌動物腸道上皮細胞更新率比一般動物低，腸壁的物質(zhì)交換也較慢。無菌條件下的各種動物通過膽汁排泄代謝產(chǎn)物的速率均減慢；如切除無菌動物的盲腸，則無菌動物與普通動物的差異縮小。無菌豚鼠和無菌兔在切除盲腸后，其生殖率增加。關于盲腸增大的原因，曾進行過許多研究，尚無明確結果。推測可能是因為飼料中的有毒物質(zhì)刺激盲腸，使其增大加長、彈性減少。正常情況下飼料中的毒性物質(zhì)可被腸道菌分解。無菌條件對兔及豚鼠的盲腸產(chǎn)生的影響最大，Sabourdy曾稱量過無菌豚鼠的盲腸（連同腸內(nèi)容物)，結果盲腸相當于豚鼠體重的1/3。

6．壽命：無菌大鼠和小鼠比普通者長壽。

四、無菌動物技術

無菌動物在自然界并不存，必須用人為的方法養(yǎng)育而成。一般將臨產(chǎn)前的健康動物用麻醉藥品或拉斷頸椎處死后，立即浸泡在37℃滅菌液中，送進無菌室（或無菌隔離器)，按無菌手術進行剖腹，切除帶胎子宮（子宮內(nèi)首先應無菌)，將其浸入消毒液里并立即輸送到另一只隔離器中，切開子宮取胎，經(jīng)用滅菌紗布揩拭仔體并斷臍（電刀切斷)后，放入隔離器內(nèi)人工喂乳或用其他品系的無菌雌鼠作保姆代養(yǎng)。象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻煩，故采用保姆代養(yǎng)。而象豚鼠因在一定程度上能自力飲乳，故人工哺乳較容易。另外，象禽類、魚類、昆蟲類等，因是在卵中無菌的前提下作出的，故用藥物將卵周圍滅菌后移入滅菌隔離器內(nèi)使其孵化即可，而且，這些動物，一般在出生后就能自力采食，故較易育成。

無菌動物的理論基礎和實踐依據(jù)在于胎盤屏障和屏障觀念，根據(jù)這個基礎開展了無菌動物工作。在無菌條件下取仔，一切操作在無菌隔離器內(nèi)進行。

（一)哺乳類無菌動物技術

小動物作子宮切除術（Hysterectomy)；大動物做子宮切開術（Hysterotomy)獲得幼仔。子宮切開對兔子可用三次，但易污染，不如子宮切除術取仔安全。大動物主要從經(jīng)濟角度考慮，采用子宮切開取仔術。取仔程序如下：

1．腹部剃毛或用硫化鈉脫毛劑脫毛。

脫毛劑配制：

硫化鋇　50克

濕潤劑　4克

甘油10克

水50毫升

作成類糊狀用以脫毛。

2．處死妊娠雌鼠。一般不用化學藥品處死，以兔影響胎鼠。如用化學藥品時，應使劑量對胎體無影響時方可使用。一般對小鼠用斷頸髓處死。較大的動物如豚鼠用氟烷（Halothane　Oxygen)吸入麻醉，不用乙醚麻醉。

3．處死的雌鼠浸泡于37℃滅菌液中2分鐘。滅菌液配制：

福爾馬林20%

季銨5%

芐烷氨水75%

4．將妊娠鼠固定住，并于腹部粘上滅菌膠布。

5．剖腹。

6．取出子宮：

⑴將子宮放入滅菌液中，之后將盛子宮的小筐遞到另一隔離器中取胎鼠。這樣，在隔離器中有充分的時間檢查其是否污染。

⑵如將子宮直接在無特定病原體條件下取胎和飼養(yǎng)則有危險，可能受染而無機會觀察。

7．用剪刀剪開子宮壁，取出胎鼠，輕按以幫助呼吸，不立即斷臍，待呼吸正常時再用電刀切斷臍帶。

8．分開胎盤，將取出的幼仔放到代乳母鼠身邊，把代乳母鼠的幼仔取出與剖腹產(chǎn)取出的幼鼠接觸，使之有同樣的氣味，便于代養(yǎng)。

9．剖腹取胎的時限。

⑴小鼠、大�。�9-10分鐘；

⑵豚鼠：5分鐘，因豚鼠耐缺氧能力低弱。

乳汁制備：首先用擠奶機獲得兔奶，冷凍干燥，經(jīng)γ射線消毒，保存于塑料袋中，貯放在隔離器內(nèi)。需用時將奶粉加水恢復干燥前的濃度，不加維生素和其他成份。須注意人工喂養(yǎng)經(jīng)常出現(xiàn)因灌喂入肺而致死。家兔3次/日，后來發(fā)現(xiàn)1次/日即可。根據(jù)家兔年齡及體重考慮每兩日加量1次。第1天喂5毫升，可維持1次/日；以后逐漸增加到4-5次/日；第3周時即可吃飼料。

自1958年以來，小鼠不用人工喂養(yǎng)。Sabourdy開始培育無菌小鼠時，每天喂5次，有時半夜去喂小鼠，實際上無此必要。自廣泛使用隔離器后，都靠代乳鼠喂養(yǎng)。Sabourdy還認為中國如開始培育無菌動物工作，不必采用人工喂養(yǎng)，因現(xiàn)在各國有許多實驗動物中心有無菌動物，運輸也方便，可以從他的或別的實驗室引進代乳鼠。

代乳鼠的最適期：在隔離器中交配，約于部腹服胎前1-2天產(chǎn)仔。C3H和C57BL品系為常用的代乳鼠。用作手術取胎的母鼠最好不是第一胎的。一般用做交配的雄鼠下午時放入，第二天上午8時將雄鼠取出。做剖腹產(chǎn)需了解雌鼠的妊娠期。特種鼠的妊娠期取足月的。小鼠性周期為4天多，如用100只雌鼠交配，應有25只雌鼠受孕，實際上若用10%已屬不錯。如果10只雌鼠受乳，用Whitten氏反應法，100只雌鼠可有30%受孕。

（二)鳥類無菌動物技術

常用鵪鶉，也用雞。研究營養(yǎng)用無菌雞，要選育無白血病的雞群。飼養(yǎng)無菌雞比較容易。雛雞出殼即可啄食，不用人工喂飼。關鍵在于消毒卵殼，因卵殼不平，不易滅菌。首先選外殼干凈的受精卵。按以下程序進行：

1．將受精卵放至濕潤劑中。

2．再放入2%升汞中浸12分鐘。

3．將浸泡過的受精卵放入隔離器中孵育。

建立無白血病雞群無從母雞選起，用這種雞卵培育無菌雞。否則僅外殼消毒是消滅不了雞白血病病毒。

五、無菌動物的飼料和飼育裝置

（一)無菌動物的飼料

無菌動物的飼料水必須符合下列要求：

1．沒有活的微生物和寄生蟲或蟲卵，因此，必須經(jīng)過充分的滅菌，一般多用高壓滅菌。有條件可用60鈷照射滅菌，效果好，而且營養(yǎng)成份破壞少，保存時間長。根據(jù)我們研究證明采用1.5-2.5Mrd60鈷γ線照射的飼料滅菌效果顯著，能保持無菌狀態(tài)達4個月以上；營養(yǎng)成份破壞較高壓滅菌法顯著少，如維生素B243.7%、E17.5%、C8.5%、蛋白質(zhì)11%、胱氨酸17.5%、賴氨酸14等；飼喂LACA小鼠和裸鼠后效果良好。值得推廣應用。

2．必須補充因高壓滅菌而破壞的營養(yǎng)成份，如：維生素B1、維生素C、泛酸等。補充的營養(yǎng)成份用濾菌器過濾后加入飼料或飲水中飼喂。為了減少營養(yǎng)成份的破壞，最好用放射線滅菌或環(huán)氧乙烷滅菌法代替高壓滅菌法。

3．無菌動物沒有腸道正常菌叢，飼料中還須補充這些細菌合成的營養(yǎng)成份。

4．飼料的組成、形態(tài)和氣味等應盡可能適合動物的習性和嗜好。

（二)無菌動物的飼育裝置

無菌動物必須在與自然界微生物完全隔絕的無菌隔離器內(nèi)飼育。舊式的無菌隔離器是用不銹鋼等金屬材料制成的，內(nèi)部用高壓蒸氣消毒，由于成本高、操作不方便，現(xiàn)在已被塑料無菌隔離器所取代。塑料隔離器是用硬透明塑料制成的，內(nèi)部用過氧乙酸等消毒液噴霧消毒，由于成本低、便于觀察、操作方www.gydjdsj.org.cn/pharm/便，目前已被廣泛采用。我國生產(chǎn)的塑料隔離器最近在中國醫(yī)學科學院實驗動物中心已通過鑒定，并已成批生產(chǎn)。

無菌隔離器必須具備下面五個條件：

1．必須是一個對微生物密閉的容器，其內(nèi)部空間和內(nèi)容物能接受高壓蒸氣或化學藥品滅菌處理。

2．隔離器的空間以及內(nèi)容可隨時被觀察。

3．隔離器內(nèi)部應隨時在視野下從外部進行工作，但不破壞內(nèi)部的無菌環(huán)境。

4．必須裝置一個有內(nèi)外門的無菌通道，動物或食物以及其它物品可以從外部無菌地輸送到隔離器內(nèi)部去，而不被壞內(nèi)部的無菌環(huán)境，送出時亦然。

5．必須裝置一個無菌進行出氣系統(tǒng)，內(nèi)部保持適度的高氣壓。

塑料無菌隔離器的結構模式見圖6-1。

圖６－１　塑料無菌隔離器

其形態(tài)大小因應用的目的和動物的品種、數(shù)量而異，一般大小為1.80米×0.65米×0.5米，但是結構原理基本相同。大體上分為收容間、緩沖間和空氣交換裝置三部分。收容間有一個消毒藥液的噴霧孔（a)和一付密封在塑料板上的橡膠手套（b)，內(nèi)部各種操作都要通過手套進行。手套是活動的，可以更換，為延長手套使用期限，手套外面加布手套。緩沖間（c)有兩個開口和一個噴霧消毒藥液的孔（d)，動物、飼料、飲水和各種用具都通過緩沖間出入，兩個開口要交互打開，以防空氣污染收容間�？諝饨粨Q裝置由空氣過濾器（e)和排氣閥（f)兩部分構成，排氣閥能阻止空氣逆流，以防污染。內(nèi)部的氣壓應比外部略高，以利于換氣。

六、無菌動物的檢查

為了確認無菌動物的無菌狀態(tài)，及時發(fā)現(xiàn)污染，必須定其進行檢查。檢查材料以糞便為主，也可檢查飼料、飲水和鋪墊物等，或用消毒棉花擦拭隔離器內(nèi)面或?qū)�動物飲食器皿表面進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基可用牛肉浸液、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、血液瓊脂、馬鈴薯瓊脂或沙保弱氏瓊脂等，分別在20℃、37℃、55℃作好氣和厭氣性培養(yǎng)。同時還要進行呼吸道支原體的檢查和各種寄生蟲檢查，對于病毒，不可能一一進行分離培養(yǎng)，一般是通過臨床觀察、細胞培養(yǎng)或病理組織學檢查作判定。

七、無菌動物在生物醫(yī)學研究中的應用