補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complementfixationtest，CFT)是用免疫溶血機(jī)制做指示系統(tǒng)，來檢測(cè)另一反應(yīng)系gydjdsj.org.cn/hushi/統(tǒng)抗原或抗體的試驗(yàn)。早在1906年Wasermann就將其應(yīng)用于梅毒的診斷，即著名的華氏反應(yīng)。這一傳統(tǒng)的試驗(yàn)經(jīng)不斷改進(jìn)，除了用于傳染病診斷和流行病學(xué)調(diào)查以外，在一些自身抗體、腫瘤相關(guān)以原以及HLA的檢測(cè)和分析中也有應(yīng)用。
該試驗(yàn)中有5種成分參與反應(yīng)，分屬于3個(gè)系統(tǒng)：①反應(yīng)系統(tǒng)，即已知的抗原（或抗體)與待測(cè)的抗體（或抗原)；②補(bǔ)體系統(tǒng)；③指示系統(tǒng)，即SRBC與相應(yīng)溶血素，試驗(yàn)時(shí)常將其預(yù)先結(jié)合在一起，形成致敏紅細(xì)胞。反應(yīng)系統(tǒng)與指示系統(tǒng)爭(zhēng)奪補(bǔ)體系統(tǒng)，先加入反應(yīng)系統(tǒng)給其以優(yōu)先結(jié)合補(bǔ)體的機(jī)會(huì)。
如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測(cè)的抗體（或抗原)，則抗原抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補(bǔ)體；再加入指示系統(tǒng)時(shí)，由于反應(yīng)液中已沒有游離的補(bǔ)體而不出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性。如果反應(yīng)系統(tǒng)中不存在的待檢的抗體（或抗原)，則在液體中仍有游離的補(bǔ)體存在，當(dāng)加入指示系統(tǒng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)溶血，是為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰性（圖14-2)。因此補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可用已知抗原來檢測(cè)相應(yīng)抗體，或用已知抗體來檢測(cè)相應(yīng)抗原。
.jpg)
.jpg)
.jpg)
圖14-2補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)示意圖
補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的改良方法較多，較常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法)等。目前以后兩種方法應(yīng)用較為廣泛，因?yàn)榭梢怨?jié)省抗原，血清標(biāo)本用量較少，特異性也較好。以下敘述以小量法為例，即抗原、抗體、溶血素、羊紅細(xì)胞各加0.1ml，補(bǔ)體加0.2ml，總量為0.6ml。
（一)試劑
1．抗原試驗(yàn)中用于檢測(cè)抗體的抗原應(yīng)適當(dāng)提純，純度愈高，特異性愈強(qiáng)。如使用粗制抗原時(shí)，須經(jīng)同樣處理的正常組織作抗原對(duì)照，以識(shí)別待檢血清中可能存在的、對(duì)正常組織成分的非特異性反應(yīng)。
2．抗原和抗本的滴定補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中，抗原與抗體按一定比例結(jié)合，因而應(yīng)通過試驗(yàn)選擇適宜的濃度比例。多采用方陣法進(jìn)行滴定，選擇抗原與抗體兩者都呈強(qiáng)陽性反應(yīng)（100％不溶血)的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價(jià)（單價(jià))。滴定方法舉例如表14-4。在試管中加入不同稀釋度的抗原，配加不同稀釋度的抗血清，另作不加抗原的抗體對(duì)照管和不加抗血清的抗原對(duì)照管。按照試驗(yàn)方法加補(bǔ)體和指示系統(tǒng)，溫育后觀察結(jié)果。在表14-4中可見1:64抗原和1:32抗體各作為1個(gè)單位。在正式試驗(yàn)中，抗原一般采用2～4個(gè)單位（1:64～1:32)，抗體采用4個(gè)單位（1:8)。
表14-4抗原和抗體的方陣滴定
| 抗原 | 抗血清稀釋倍數(shù) | 抗原對(duì)照 | |||||||
| 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | 1:512 | ||
| 1:4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 2 | 0 |
| 1:8 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 1:16 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 2 | 2 | ± | 0 |
| 1:32 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 1 | ± | 0 | 0 |
| 1:64 | 4 | 4 | 4 | ④ | 2 | ± | 0 | 0 | 0 |
| 1:128 | 4 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1:256 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1:512 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 抗體對(duì)照 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
注：1、2、3、4分別表示溶血反應(yīng)強(qiáng)度＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋；0為不溶血。
3．補(bǔ)體滴定按表14-5逐步加入各試劑，溫育后觀察最少量補(bǔ)體能產(chǎn)生完全溶血者，確定為1個(gè)實(shí)用單位，正式試驗(yàn)中使用2個(gè)實(shí)用單位。如形14-5中的結(jié)果為1:60的補(bǔ)體0.12ml可產(chǎn)生完全溶血，按比例公式0.12×2:60＝0.2:X計(jì)算，X＝50；即實(shí)際應(yīng)用中的2個(gè)補(bǔ)體實(shí)用單位應(yīng)為1:50稀釋的補(bǔ)體0.2ml。
表14-5補(bǔ)體的滴定
| 管號(hào) | 1:60補(bǔ)體（ml) | 緩沖液（ml) | 稀釋抗原（ml) | 致敏SRBC （ml) | 結(jié)果 | ||
| 1 | 0.04 | 0.26 | 0.1 | 放 置 37℃水 浴30min | 0.2 | 放 置 37℃水 浴30min | 不溶血 |
| 2 | 0.06 | 0.24 | 0.1 | 0.2 | 不溶血 | ||
| 3 | 0.08 | 0.22 | 0.1 | 0.2 | 微溶血 | ||
| 4 | 0.10 | 0.20 | 0.1 | 0.2 | 微溶血 | ||
| 5 | 0.12 | 0.18 | 0.1 | 0.2 | 全溶血 | ||
| 6 | 0.14 | 0.16 | 0.1 | 0.2 | 全溶血 |
（二)血清標(biāo)本
采集血液標(biāo)本后及時(shí)分離血清，及時(shí)檢驗(yàn)或?qū)⒀灞４嬗冢?0℃。血清在試驗(yàn)前應(yīng)先加熱56℃30min（或60℃3min)以破壞補(bǔ)體和除去一些非特異因素。血清標(biāo)本遇有抗補(bǔ)本現(xiàn)象時(shí)可做下列處理之一：①加熱提高12；②－20℃凍融后離心去沉淀；③以3mmol/L鹽酸處理；④加入少量補(bǔ)體后再加熱滅活；⑤以白陶土處理；⑥通入CO2；⑦以小白鼠肝粉處理；⑧用含10％新鮮雞蛋清的生理鹽水稀釋補(bǔ)體。
（三)正式試驗(yàn)
以小量法測(cè)定抗體的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)為例。按表14-6逐步加入各種試劑，溫育后先觀察各類對(duì)照管，應(yīng)與預(yù)期的結(jié)果吻合。陰性、陽性對(duì)照管中應(yīng)分別為明確的溶血與不溶血；抗體或抗原對(duì)照管、待檢血清對(duì)照管、陽性和陰性對(duì)照的對(duì)照管都應(yīng)完全溶血。綿羊紅細(xì)胞對(duì)照管不應(yīng)出現(xiàn)自發(fā)性溶血。補(bǔ)體對(duì)照管應(yīng)呈現(xiàn)2U為全溶，1U為全溶略帶有少許紅細(xì)胞，0.5U應(yīng)不溶。如0.5U補(bǔ)體對(duì)照出現(xiàn)全溶表明補(bǔ)體用量過多；如2U對(duì)照管不出現(xiàn)溶血，說明補(bǔ)體用量不夠，對(duì)結(jié)果都有影響，應(yīng)重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，受檢血清不溶血為陽性，溶血為陰性。
表14-6測(cè)定抗體的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)操作程序
| 反應(yīng)物（ml) | 待檢血清管 | 陽性對(duì)照管 | 陰性對(duì)照管 | 抗原對(duì)照管 | 補(bǔ)體對(duì)照管 | 紅細(xì)胞對(duì)照管 | |||||
| 測(cè)定 | 對(duì)照 | 測(cè)定 | 對(duì)照 | 測(cè)定 | 對(duì)照 | 2U | 1U | 0.5U | |||
| 稀釋血清 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | － | － | － | － | － |
| 抗原 | 0.1 | － | 0.1 | － | 0.1 | － | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | － |
| 緩沖液 | － | 0.1 | － | 0.1 | － | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.4 |
| 2U補(bǔ)體 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | － | － | － |
| 1U補(bǔ)體 | － | － | － | － | － | － | － | － | 0.2 | － | － |
| 0.5U補(bǔ)體 | － | － | － | － | － | － | － | － | － | 0.2 | － |
| 混勻，置37℃1h或4℃16～18h | |||||||||||
| 致敏紅細(xì)胞 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 混勻，置37℃30min后觀察結(jié)果 |
補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是一種傳統(tǒng)的免疫學(xué)技術(shù)，能夠沿用至今說明它本身有一定的優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高。補(bǔ)體活化過程有放大作用，比沉淀反應(yīng)和凝集反應(yīng)的靈敏度高得多，能測(cè)定0.05μg/ml的抗體，可與間接凝集法的靈敏度相當(dāng)。②特異性強(qiáng)。各種反應(yīng)成分事先都經(jīng)過滴定，選擇了最佳比例，出現(xiàn)交叉反應(yīng)的機(jī)率較小，尤其用小量法或微量法時(shí)。③應(yīng)用面廣，可用于檢測(cè)多種類型的抗原或抗體。④易于普及，試驗(yàn)結(jié)果顯而易見；試驗(yàn)條件要求低，不需要特殊儀器或只用光電比色計(jì)即可。
補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)可應(yīng)用在以下幾方面：①傳染病診斷。病原性抗原及相應(yīng)抗體的檢測(cè)。②其他抗原的檢測(cè)。例如腫瘤相關(guān)抗原、血跡中的蛋白質(zhì)鑒定、HLA分型等。③自身抗體檢測(cè)。
但是補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)參與反應(yīng)的成分多，影響gydjdsj.org.cn/job/因素復(fù)雜，操作步驟繁鎖并且要求十分嚴(yán)格，稍有疏忽便會(huì)得出不正確的結(jié)果，所以在多種測(cè)定中已被其他更易被接受的方法所取代。但對(duì)于免疫學(xué)技術(shù)的基本訓(xùn)練仍是一個(gè)很好的試驗(yàn)。
