免疫學和免疫學檢驗:第二節(jié)　補體結(jié)合試驗

補體結(jié)合試驗（complementfixationtest，CFT)是用免疫溶血機制做指示系統(tǒng)，來檢測另一反應(yīng)系gydjdsj.org.cn/hushi/統(tǒng)抗原或抗體的試驗。早在1906年Wasermann就將其應(yīng)用于梅毒的診斷，即著名的華氏反應(yīng)。這一傳統(tǒng)的試驗經(jīng)不斷改進，除了用于傳染病診斷和流行病學調(diào)查以外，在一些自身抗體、腫瘤相關(guān)以原以及HLA的檢測和分析中也有應(yīng)用。

一、類型及原理

該試驗中有5種成分參與反應(yīng)，分屬于3個系統(tǒng)：①反應(yīng)系統(tǒng)，即已知的抗原（或抗體)與待測的抗體（或抗原)；②補體系統(tǒng)；③指示系統(tǒng)，即SRBC與相應(yīng)溶血素，試驗時常將其預(yù)先結(jié)合在一起，形成致敏紅細胞。反應(yīng)系統(tǒng)與指示系統(tǒng)爭奪補體系統(tǒng)，先加入反應(yīng)系統(tǒng)給其以優(yōu)先結(jié)合補體的機會。

如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測的抗體（或抗原)，則抗原抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補體；再加入指示系統(tǒng)時，由于反應(yīng)液中已沒有游離的補體而不出現(xiàn)溶血，是為補體結(jié)合試驗陽性。如果反應(yīng)系統(tǒng)中不存在的待檢的抗體（或抗原)，則在液體中仍有游離的補體存在，當加入指示系統(tǒng)時會出現(xiàn)溶血，是為補體結(jié)合試驗陰性（圖14-2)。因此補體結(jié)合試驗可用已知抗原來檢測相應(yīng)抗體，或用已知抗體來檢測相應(yīng)抗原。

圖14-2補體結(jié)合試驗示意圖

二、試驗方法

補體結(jié)合試驗的改良方法較多，較常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法)等。目前以后兩種方法應(yīng)用較為廣泛，因為可以節(jié)省抗原，血清標本用量較少，特異性也較好。以下敘述以小量法為例，即抗原、抗體、溶血素、羊紅細胞各加0.1ml，補體加0.2ml，總量為0.6ml。

（一)試劑

1．抗原試驗中用于檢測抗體的抗原應(yīng)適當提純，純度愈高，特異性愈強。如使用粗制抗原時，須經(jīng)同樣處理的正常組織作抗原對照，以識別待檢血清中可能存在的、對正常組織成分的非特異性反應(yīng)。

2．抗原和抗本的滴定補體結(jié)合試驗中，抗原與抗體按一定比例結(jié)合，因而應(yīng)通過試驗選擇適宜的濃度比例。多采用方陣法進行滴定，選擇抗原與抗體兩者都呈強陽性反應(yīng)（100％不溶血)的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價（單價)。滴定方法舉例如表14-4。在試管中加入不同稀釋度的抗原，配加不同稀釋度的抗血清，另作不加抗原的抗體對照管和不加抗血清的抗原對照管。按照試驗方法加補體和指示系統(tǒng)，溫育后觀察結(jié)果。在表14-4中可見1:64抗原和1:32抗體各作為1個單位。在正式試驗中，抗原一般采用2～4個單位（1:64～1:32)，抗體采用4個單位（1:8)。

表14-4抗原和抗體的方陣滴定

注：1、2、3、4分別表示溶血反應(yīng)強度＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋；0為不溶血。

3．補體滴定按表14-5逐步加入各試劑，溫育后觀察最少量補體能產(chǎn)生完全溶血者，確定為1個實用單位，正式試驗中使用2個實用單位。如形14-5中的結(jié)果為1:60的補體0.12ml可產(chǎn)生完全溶血，按比例公式0.12×2:60＝0.2:X計算，X＝50；即實際應(yīng)用中的2個補體實用單位應(yīng)為1:50稀釋的補體0.2ml。

表14-5補體的滴定

（二)血清標本

采集血液標本后及時分離血清，及時檢驗或?qū)⒀�清保存于�?0℃。血清在試驗前應(yīng)先加熱56℃30min（或60℃3min)以破壞補體和除去一些非特異因素。血清標本遇有抗補本現(xiàn)象時可做下列處理之一：①加熱提高12；②－20℃凍融后離心去沉淀；③以3mmol/L鹽酸處理；④加入少量補體后再加熱滅活；⑤以白陶土處理；⑥通入CO₂；⑦以小白鼠肝粉處理；⑧用含10％新鮮雞蛋清的生理鹽水稀釋補體。

（三)正式試驗

以小量法測定抗體的補體結(jié)合試驗為例。按表14-6逐步加入各種試劑，溫育后先觀察各類對照管，應(yīng)與預(yù)期的結(jié)果吻合。陰性、陽性對照管中應(yīng)分別為明確的溶血與不溶血；抗體或抗原對照管、待檢血清對照管、陽性和陰性對照的對照管都應(yīng)完全溶血。綿羊紅細胞對照管不應(yīng)出現(xiàn)自發(fā)性溶血。補體對照管應(yīng)呈現(xiàn)2U為全溶，1U為全溶略帶有少許紅細胞，0.5U應(yīng)不溶。如0.5U補體對照出現(xiàn)全溶表明補體用量過多；如2U對照管不出現(xiàn)溶血，說明補體用量不夠，對結(jié)果都有影響，應(yīng)重復(fù)進行試驗。補體結(jié)合試驗結(jié)果，受檢血清不溶血為陽性，溶血為陰性。

表14-6測定抗體的補體結(jié)合試驗操作程序

三、應(yīng)用和評價

補體結(jié)合試驗是一種傳統(tǒng)的免疫學技術(shù)，能夠沿用至今說明它本身有一定的優(yōu)點：①靈敏度高。補體活化過程有放大作用，比沉淀反應(yīng)和凝集反應(yīng)的靈敏度高得多，能測定0.05μg/ml的抗體，可與間接凝集法的靈敏度相當。②特異性強。各種反應(yīng)成分事先都經(jīng)過滴定，選擇了最佳比例，出現(xiàn)交叉反應(yīng)的機率較小，尤其用小量法或微量法時。③應(yīng)用面廣，可用于檢測多種類型的抗原或抗體。④易于普及，試驗結(jié)果顯而易見；試驗條件要求低，不需要特殊儀器或只用光電比色計即可。

補體結(jié)合試驗可應(yīng)用在以下幾方面：①傳染病診斷。病原性抗原及相應(yīng)抗體的檢測。②其他抗原的檢測。例如腫瘤相關(guān)抗原、血跡中的蛋白質(zhì)鑒定、HLA分型等。③自身抗體檢測。

但是補體結(jié)合試驗參與反應(yīng)的成分多，影響gydjdsj.org.cn/job/因素復(fù)雜，操作步驟繁鎖并且要求十分嚴格，稍有疏忽便會得出不正確的結(jié)果，所以在多種測定中已被其他更易被接受的方法所取代。但對于免疫學技術(shù)的基本訓練仍是一個很好的試驗。