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用人工培養(yǎng)的方法，將病料中的病原分離出來，是診斷雞的侵襲病最確切的依據(jù)之一。通過細(xì)菌的分離培養(yǎng)，選出可疑的病原菌，再通過生化試驗(yàn)、血清學(xué)診斷和動(dòng)物接種等方法作出鑒定。
1．病原菌的分離培養(yǎng)
根據(jù)采集病料的種類不同，采取不同的方法分離純培養(yǎng)物。如果病料是病變組織，又是用無菌方法采集的，可將病料直接涂抹在固體培養(yǎng)基平皿上，或用鉑耳環(huán)釣取少許組織，劃線接種于瓊脂平面上，生長(zhǎng)后，如果細(xì)菌形態(tài)是一致的，則任選幾個(gè)菌落移植于瓊脂斜面上作鑒定。
如果菌落形態(tài)不一致，則應(yīng)在每種菌落中任選1～2個(gè)，移植于瓊脂斜面上分別鑒定。如果雜菌太多可采用其它方法進(jìn)行純培養(yǎng)；如果病料是糞、呼吸道分泌物等，污染雜菌較多，則根據(jù)分離的病原菌特性，采取一些對(duì)病原菌無害，但對(duì)雜菌有殺滅作用的方法，事先處理材料，以除去雜菌，然后接種培養(yǎng)基，或在培養(yǎng)基中加入一些不妨礙病原菌生長(zhǎng)，但對(duì)雜菌有抑制作用的抑菌藥物，以得到純的培養(yǎng)物。例如，分離呼吸道分泌物中的結(jié)核菌，可先用3％氫氧化鈉或4％～6％硫酸處理病料，雜菌被殺死而結(jié)核菌不會(huì)死亡，接種培養(yǎng)基后，將得到結(jié)核菌純培養(yǎng)物；如果從腸道內(nèi)容物或從被不產(chǎn)生芽胞的雜菌污染的培養(yǎng)物中分離能形成芽胞的細(xì)菌，可將材料或培養(yǎng)物在 80℃加熱15分鐘。在此溫度下不形成芽胞的雜菌將被殺死，形成芽胞的細(xì)菌仍可以耐過。取此材料接種培養(yǎng)基，即獲得純培養(yǎng)物；有些污染雜菌的病料和培養(yǎng)物，可以通過易感動(dòng)物排除雜菌，而得到病原菌純培養(yǎng)物。
(1)劃線分離培養(yǎng)法
此法為常用的細(xì)菌分離培養(yǎng)法。平板劃線培養(yǎng)法常用的有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法，其目的都是達(dá)到使被檢材料作適當(dāng)稀釋，以求獲得獨(dú)立單個(gè)存在的菌落，防止發(fā)育成菌苔，以致不宜鑒別其菌落性狀。劃線培養(yǎng)的方法是左手持皿，用其左手拇指、食指及中指將皿蓋揭成20度左右的角度(角度愈小愈好，以免空氣中的細(xì)菌進(jìn)入皿中將培養(yǎng)基污染)。右手持接種環(huán)，在火焰上滅菌，將材料少許涂布于培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)上多余的材料在火焰上燒毀，待接種環(huán)冷卻后，再與涂材料處輕輕接觸，進(jìn)行劃線。劃線后置37℃溫箱內(nèi)，24小時(shí)后觀察菌落生長(zhǎng)情況。劃線時(shí)先將接種環(huán)稍稍彎曲，這樣易和平皿內(nèi)瓊脂面平行，不致劃破培養(yǎng)基。劃線中不宜過多地重復(fù)舊線，以免形成菌苔。
(2)斜面培養(yǎng)基分離培養(yǎng)法
本法主要用于純菌的移植，某些鑒別用斜面培養(yǎng)基的接種。
從分離的平皿培養(yǎng)基上，選取可疑菌落移植到斜面培養(yǎng)基上作純菌繁殖。其方法是右手持接種環(huán)，接種環(huán)燒灼滅菌，左手打開平皿蓋，用接種環(huán)挑取所需菌落，然后左手蓋上平皿蓋，立即取斜面管，將試管底部放在大拇指、食指和中指之間，以右手小指拔去試管棉塞，然后將接種環(huán)伸人試管，勿碰及斜面和管壁，直達(dá)斜面底部，從斜面底部開始在培養(yǎng)基上劃線，向上至斜面頂端為止。管口通過火焰滅菌，再將小指夾持的棉塞塞好。接種完畢，將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌后放下，在斜面管壁上注明日期，置37℃培養(yǎng)箱中。
從菌種管移種于斜面培養(yǎng)基時(shí)，將兩支試管置于左手拇指、食指和中指間，轉(zhuǎn)動(dòng)兩管棉塞，以便接種時(shí)容易拔取。使兩管口對(duì)齊，管身略傾斜，管口靠近酒精燈火焰但不要接觸火焰。右手持接種環(huán)，在火焰上滅菌后，用右手小指與無名指分別拔去兩管棉塞，并將管口進(jìn)行火焰滅菌。將接種環(huán)伸人菌種管內(nèi)，先在無菌生長(zhǎng)的瓊脂上接觸使其冷卻，再挑取菌落后拔出接種環(huán)立即伸入另一管斜面培養(yǎng)基上，劃線方法同前述。將火焰略燒一下管口再將棉塞塞好。接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌放下，經(jīng)接種的斜面管上注明日期、菌名后，置培養(yǎng)箱內(nèi)，經(jīng)37℃培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。
(3)液體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)法
方法與斜面培養(yǎng)基接種基本相同。不同的是挑取菌苔后，接種在液體培養(yǎng)基管中，不是劃線方式接種，而是將接種環(huán)上的菌苔輕輕摩擦在液面部管壁上即可。
(4)半固體培養(yǎng)基穿刺分離培養(yǎng)法
方法上基本與斜面培養(yǎng)基接種相同。用接種環(huán)挑取菌苔后，垂直刺入培養(yǎng)基內(nèi)，從培養(yǎng)基表面一直刺人管底，然后按原方向垂直退出即可。
(5)平板傾注培養(yǎng)法
一般用于病料的細(xì)菌量的測(cè)定。將被檢樣作10倍遞增稀釋，通常作10-1～10-6稀釋，然后以滅菌吸管取各級(jí)稀釋液1毫升，置滅菌平皿中，立即加注已溶化并冷卻至50℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后置37℃培養(yǎng)24～48／小時(shí)，供計(jì)數(shù)用。
(6)特殊培養(yǎng)基分離法
供分離用的特殊培養(yǎng)基，一般為在培養(yǎng)基中加入適量化學(xué)藥品、抗生素或染料等，來抑制非目的雜菌的生長(zhǎng)，而提高目的菌的檢出率。
抑菌作用：有些藥品對(duì)某些細(xì)菌有極強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)另一些細(xì)菌則否，故可利用此種特性進(jìn)行細(xì)菌分離，例如通常在培養(yǎng)基中gydjdsj.org.cn/shouyi/zhujiage/zhurou/加入青霉素抑制革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng)，以分離革蘭氏陰性菌。染料的抑菌作用有選擇性，如結(jié)晶紫、龍膽紫、孔雀綠、煌綠等對(duì)革蘭氏陽性菌的作用敏感，培養(yǎng)基中加1：200000的結(jié)晶紫可抑制葡萄球菌的生長(zhǎng)；1：5000000的孔雀綠可抑制除結(jié)核桿菌外的一般細(xì)菌；1：5 000煌綠可抑制大腸桿菌等。故某些培養(yǎng)基中選用某些染料作為特殊成分。亞硒酸鈉用于腸道致病菌的分離，因其對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用，故能提高糞便和大腸桿菌污染較大的檢材的腸道致病菌的檢出率。膽鹽對(duì)革蘭氏陽性菌有抑制力，而與枸櫞酸鈉共用也可抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，故腸道致病菌分離的培養(yǎng)基也常用。疊氮酸鈉可抑制革蘭氏陰性菌，尤其是變形桿菌的生長(zhǎng)，在每100毫升的培養(yǎng)基中加入1％疊氮酸鈉水溶液2毫升即可。
殺菌作用：將病料如結(jié)核病料加入15％硫酸溶液處理，其它雜菌皆被殺死，結(jié)核菌因具有抗酸性而存活。
鑒別作用：根據(jù)細(xì)菌對(duì)某種糖的分解能力，通過培養(yǎng)基中指示劑的變化來鑒別某種細(xì)菌。例如遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基可以用做鑒別大腸桿菌與沙門氏菌。
(7)通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分離法
當(dāng)分離某種病原菌時(shí)，可將被檢材料注射于感受性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，如結(jié)核菌材料注射于豚鼠體內(nèi)，雜菌不能發(fā)育，而豚鼠終必得慢性結(jié)核病而死。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死后，取心血或臟器用以分離細(xì)菌。有時(shí)甚至可得到純培養(yǎng)。
