| 公開(公告)號 | CN1462803A |
| 公開(公告)日 | 2003.12.24 |
| 申請(專利)號 | CN03134254.X |
| 申請日期 | 2003.06.05 |
| 專利名稱 | 哺乳動物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝 |
| 主分類號 | C12N15/85 |
| 分類號 | C12N15/85;C12N15/11;C12N15/70;C12N5/00;C12Q1/68;C12P21/02 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 劉軍;郭穎;薛采芳 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 劉軍;郭穎;薛采芳 |
| 地址 | 710032陜西省西安市長樂西路17號第四軍醫(yī)大學(xué)病原生物學(xué)教研室 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 徐文權(quán) |
| 國省代碼 | 陜西;61 |
| 主權(quán)項 | 一種哺乳動物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝，其特征在于：1)根據(jù)人源性U6啟動子的序列進(jìn)行引物設(shè)計正向引物：5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物：5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有Xba I和Kpn I酶切位點(diǎn)；2)擴(kuò)增目的基因用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞在800-1000rpm轉(zhuǎn)速下離心3-5分鐘，收集2×106-5×106個細(xì)胞；以200μL的磷酸鹽緩沖液重懸收集的細(xì)胞，再依次加入20μL的蛋白酶K和200μL的DNeasyTM Tissue Kit緩沖液AL，震蕩混勻，在70℃下放置10分鐘，再加入200μL濃度為96％-100％的乙醇，震蕩混勻后，加入到DNeasyTM Tissue Kit離心柱中，在8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘后，再次加入500μL的DNeasyTM Tissue Kit緩沖液AW1，以8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘，加入500μL的DNeasyTM Tissue Kit緩沖液AW2，在13000-14000rpm轉(zhuǎn)速下離心3-5分鐘，將DNeasyTM Tissue Kit離心柱放到一個干凈的1.5mL-2mL的離心管中，加入200μL的DNeasyTMTissue Kit緩沖液AE，室溫下放置1-3分鐘，在8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘，再向DNeasyTM Tissue Kit離心柱中加入200μL的DNeasyTM TissueKit緩沖液AE，室溫下放置1-3分鐘，在8000-10000rpm轉(zhuǎn)速下離心1-2分鐘，得到HepG2細(xì)胞的基因組DNA；在PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl濃度為25mmol/L的MgCl2、4μl濃度為2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2細(xì)胞的基因組DNA和30μl的純水，在94℃延伸5分鐘后，于94℃延伸30秒、55-65℃延伸30秒、再于72℃延伸1-10分鐘，共循環(huán)25-40次，然后在72℃延伸7-10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；3)哺乳動物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA Fragment Purification Kit純化回收，純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xba I和Kpn I酶切后，與同樣經(jīng)Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用Xba I和Kpn I酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動序列測定儀進(jìn)行，構(gòu)建成功的哺乳動物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體命名為pUC18U6。 |
| 摘要 | 哺乳動物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體的制備工藝，根據(jù)人源性U6啟動子的序列進(jìn)行引物設(shè)計，以HepG2細(xì)胞的基因組DNA為模板擴(kuò)增目的基因得到PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物經(jīng)XbaI和KpnI酶切后，與同樣經(jīng)XbaI和KpnI酶切的pUC18在T4連接酶作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10gold株，以質(zhì)粒純化試劑盒純化重組質(zhì)粒，用XbaI和KpnI酶切鑒定，挑選酶切鑒定陽性的質(zhì)粒測序，序列測定采用雙脫氧鏈末端終止法，構(gòu)建哺乳動物細(xì)胞小干擾核糖核酸表達(dá)載體pUC18U6，本載體可以在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)小干擾核糖核酸，抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，從而可以用于研究相應(yīng)基因的功能；抑制病毒基因、癌基因等致病基因的表達(dá)，則可用于治療病毒性疾病和腫瘤等疾病。 |
| 國際公布 |
