| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1485434A |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2004.03.31 |
| 申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào) | CN02139106.8 |
| 申請(qǐng)日期 | 2002.09.26 |
| 專(zhuān)利名稱 | 氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶識(shí)別型蛋白芯片的制備方法 |
| 主分類(lèi)號(hào) | C12Q1/48 |
| 分類(lèi)號(hào) | C12Q1/48 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人 | 中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 謝斌;孟慶來(lái);謝衛(wèi)紅 |
| 地址 | 430071湖北省武漢市武昌小洪山 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu) | 武漢科宏專(zhuān)利事務(wù)所 |
| 代理人 | 王敏鋒 |
| 國(guó)省代碼 | 湖北;42 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶識(shí)別型蛋白芯片的制備方法，包括下列步驟：A、制備熒光物質(zhì)IAEDANS標(biāo)記的轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸；B、把精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶基因和strep-tag序列進(jìn)行基因重組，并合成精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白，回收后用液閃記數(shù)儀來(lái)檢測(cè)其活力；C、向表面修飾有親和素的芯片樣孔中加入反應(yīng)試劑，使其終濃度為精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白50到100nmol/L，氯化鈉為150nmol/L，乙二胺四乙酸鈉為1mmol/L，在PH8.0，20℃條件下溫浴20分鐘，使精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白固定到芯片表面，再用無(wú)菌水清洗，4℃晾干；D、向固定化精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶的樣孔中加入反應(yīng)試劑，使其終濃度為T(mén)ris/鹽酸50mmol/L，氯化鎂8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L，熒光IAEDANS標(biāo)記的精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸534μmol/L，在PH7.4，37℃下溫浴5到7分鐘，使精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸分子均勻而穩(wěn)定的結(jié)合到精氨酰tRNA合成酶上，后用氯化鎂8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片表面，4℃晾干；E、向步驟D中制備的精氨酰轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸復(fù)合物中加入反應(yīng)試劑，使終濃度為精氨酸0.1mmol/L，乙二胺四乙酸鈉為0.1mmol/L，氯化鉀80mmol/L，二硫蘇糖醇0.5mmol/L，在37℃，PH7.4條件下溫浴5分鐘后，停止反應(yīng)，以氯化鎂8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片；F、把甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、洛氨酸、色氨酸、組氨酸、脯氨酸相應(yīng)氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶的基因都與strep-tag制成融合蛋白，再重復(fù)A、B、C、D、E的步驟在一塊芯片的20個(gè)孔中陣列固相出20種不同的氨酰基轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶-轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸復(fù)合物，制成氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶識(shí)別型芯片。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)了一種氨酰基轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(tRNA)合成酶識(shí)別型蛋白芯片的制備方法，它適用于蛋白質(zhì)中基本氨基酸組分的檢測(cè)。其特征在于將組成蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸對(duì)應(yīng)的氨酰基轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶(AARS)以陣列形式固定到芯片表面，再在一定條件下把20種熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸固定到相應(yīng)的合成酶上去，形成轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸-氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶芯片。該芯片就可利用氨�；D(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸合成酶對(duì)其相應(yīng)氨基酸的特異識(shí)別作用來(lái)檢測(cè)該種氨基酸在蛋白質(zhì)中存在與否。最后綜合20個(gè)樣孔的反應(yīng)情況，應(yīng)用熒光掃描可檢測(cè)出蛋白質(zhì)中氨基酸的組成。本發(fā)明具有準(zhǔn)確，靈敏，快速，方便的特點(diǎn)。 |
| 國(guó)際公布 |
