| 公開(公告)號(hào) | CN1204246C |
| 公開(公告)日 | 2005.06.01 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN02136919.4 |
| 申請(qǐng)日期 | 2002.09.10 |
| 專利名稱 | 長春花完全適應(yīng)型細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生成吲哚類生物堿的方法 |
| 主分類號(hào) | C12N5/04 |
| 分類號(hào) | C12N5/04 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 上海中醫(yī)藥大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 鄭珍貴;劉滌;胡之壁;周煜 |
| 地址 | 200032 上海市徐匯區(qū)零陵路530號(hào)67＃ |
| 頒證日 | |
| 國際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海新天專利代理有限公司 |
| 代理人 | 孫躍虹 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種應(yīng)用長春花細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生成吲哚類生物堿的方法，其特征在于該方法包括下列步驟：(1)按配方配制生長和生產(chǎn)培養(yǎng)基：生長培養(yǎng)基mg/L生產(chǎn)培養(yǎng)基mg/L(NH4)2SO413430KNO32000400CaCl22H2O.150210MgSO47H2O250290NaH2PO4H2O15030KI0.75H3BO33.0MnSO4·4H2O10ZnSO4·7H2O2.0Na2MoO4·2H2O0.25CuSO4·5H2O0.025CoCl2·6H2O0.025FeSO4·7H2O27.827.8Na2·EDTA·2H2O37.337.3肌醇100100煙酸00.5鹽酸吡哆醇00.5鹽酸硫胺素103蔗糖2％-3％w/v白砂糖3％w/vpH5.6-5.8(2)完全適應(yīng)型長春花細(xì)胞系制備1)以長春花種子為材料，經(jīng)滅菌并培養(yǎng)得到無菌苗；2)以所獲無菌苗的莖、葉等器官為外植體，在B5固體基本培養(yǎng)基加上2，4-D2mg/L和KTO.2mg/L培養(yǎng)，溫度25+1℃，經(jīng)4周暗培養(yǎng)，在外植體的切口部位形成愈傷組織；3)將所得到的愈傷組織用上述2)相同的培養(yǎng)基培養(yǎng)10代，平均三周繼代一次，培養(yǎng)溫度25+1℃，無光照；4)將所得的愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)，在上述2)所述培養(yǎng)基中逐漸減少2，4-D用量，培養(yǎng)8-10代后，將2，4-D減少到零，固體B5培養(yǎng)基上的培養(yǎng)周期為4周，或液體B5培養(yǎng)基上的培養(yǎng)周期為12-15天，形成穩(wěn)定的完全適應(yīng)型長春花細(xì)胞系；(3)按生長培養(yǎng)基配方制備生長培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)至pH5.4-5.6，分裝于250ml三角瓶中，封口并高溫滅菌，以步驟(2)方法制得的細(xì)胞為種源，接種于上述生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增，培養(yǎng)條件為溫度25±1℃，暗培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速110-120轉(zhuǎn)/分鐘，10天繼代一次，作為種子細(xì)胞；(4)按生產(chǎn)培養(yǎng)基配方制備生產(chǎn)培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)至pH5.4-5.6，分裝于1000ml三角瓶中，每瓶300-400ml，按15％W/V接入種子細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，溫度25±1℃，搖床轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘，黑暗，培養(yǎng)10-12天后，提取生物堿。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種激素完全適應(yīng)型長春花細(xì)胞培養(yǎng)生成吲哚類生物堿的新方法。本發(fā)明以野生長春花種子為原始材料，獲得長春花無菌苗，進(jìn)一步誘導(dǎo)出愈傷組織，經(jīng)過多代定向誘導(dǎo)馴化，建立了適合大規(guī)模培養(yǎng)的激素完全適應(yīng)型細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該培養(yǎng)物中總生物堿含量和野生長春花相當(dāng)，但培養(yǎng)物中不含具有細(xì)胞毒的長春堿和長春新堿。 |
| 國際公布 |
