| 公開(公告)號 | CN1624145A |
| 公開(公告)日 | 2005.06.08 |
| 申請(專利)號 | CN200410060972.6 |
| 申請日期 | 2004.10.19 |
| 專利名稱 | 一種高通量直接定向克隆構建重組腺病毒的方法 |
| 主分類號 | C12N15/861 |
| 分類號 | C12N15/861;C12N15/66 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 湖北大學 |
| 發(fā)明(設計)人 | 馬立新;張娟;陶然 |
| 地址 | 430062湖北省武漢市武昌區(qū)寶集安 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 武漢金堂專利事務所 |
| 代理人 | 丁齊旭 |
| 國省代碼 | 湖北;42 |
| 主權項 | 一種高通量直接定向克隆構建重組腺病毒的方法，主要包括一個已有的腺病毒表達載體和經PCR引物擴增的目的基因，其特征在于通過對已有的腺病毒載體系統(tǒng)進行成功的定點誘變和同源重組的修飾，在該載體中引入了兩個唯一的特殊限制性內切酶酶切位點序列和一個抗性基因表達單元，在擴增目標基因的一對PCR引物的5’端分別引進3～5個特定的堿基，在dTTP、或者dATP、或者dGTP、或者dCTP存在條件下，擴增產物經T4DNA聚合酶消化后產生的粘性末端與載體雙酶切得到的粘性末端匹配，從而可以定向克隆在經ClaI、AscI雙酶切的載體上，轉化大腸桿菌，通過抗性篩選及PCR鑒定或功能鑒定得到重組質粒，重組質粒經線性化后，可直接轉染腺病毒包裝細胞系，得到重組腺病毒粒子。 |
| 摘要 | 本發(fā)明提出了一種能夠直接定向與用T4DNA聚合酶消化經特殊設計的引物擴增的PCR產物進行連接，然后通過抗性篩選，從而一步構建得到重組腺病毒質粒的方法。得到的重組腺病毒質粒經過限制性內切酶PacI線性化，轉化哺乳動物包裝細胞系，就能夠得到成熟的重組腺病毒。利用本發(fā)明能夠高通量構建重組腺病毒，以盡可能真實的表達哺乳動物cDNA，且構建重組腺病毒的實驗周期短，成本低，特別適合大規(guī)模表達哺乳動物來源的cDNA。是一個非常有效的構建重組腺病毒的方法。 |
| 國際公布 |
