| 公開(公告)號 | CN1276086C |
| 公開(公告)日 | 2006.09.20 |
| 申請(專利)號 | CN03142232.2 |
| 申請日期 | 2003.08.13 |
| 專利名稱 | 一類雙鏈RNA分子及其在制備抑制乙型肝炎病毒復(fù)制藥物中的應(yīng)用 |
| 主分類號 | C12N15/70(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/70(2006.01)I;C12P19/34(2006.01)I;A61K31/7088(2006.01)I;A61P1/16(2006.01)I;A61P31/12(2006.01)I;C12R1/19(2006.01)N |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 復(fù)旦大學(xué);上海恒達(dá)科技發(fā)展股份有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 錢志康;宣寶琴;徐劍鋒;李 琳;閔太善;程小偉;史順成;黃偉達(dá) |
| 地址 | 200433上海市邯鄲路220號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海正旦專利代理有限公司 |
| 代理人 | 陸 飛 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項 | 一種利用大腸桿菌發(fā)酵制備RNAi用ldsRNA和siRNA分子的方法，其特征在于包括構(gòu)建ldsRNA表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，通過大規(guī)模發(fā)酵，用堿-SDS法抽提發(fā)酵菌體得到全RNA和質(zhì)粒DNA的混合物；該混合物用CF-11柱進(jìn)行純化得到ldsRNA，并利用大腸桿菌RNaseIII將ldsRNA切成12-30bp的siRNA；其中，構(gòu)建在大腸桿菌中表達(dá)長鏈dsRNA的表達(dá)載體的步驟如下：(1)將目的基因片段以相反的方向?qū)⒒虻?’端連接到第三段DNA片段的兩側(cè)，然后克隆到帶有一個T7啟動子的載體中去，當(dāng)把此表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到能表達(dá)T7RNA聚合酶的宿主菌內(nèi)后，目的基因的正反兩個方向的DNA鏈以及兩者之間的第三段DNA鏈就能被依次轉(zhuǎn)錄，成為一條連續(xù)的RNA鏈；或者(2)利用帶有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，在合適的位置加入抗性基因和多克隆位點(diǎn)，并在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別加入相對的兩個啟動子以及終止子，當(dāng)在多克隆位點(diǎn)中插入目的DNA片段后就可以以正反兩個方向轉(zhuǎn)錄RNA；上述步驟中，所選的目的基因為乙肝病毒基因組中的任何片段。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種利用大腸桿菌發(fā)酵制備RNA干擾用雙鏈RNA分子或小干擾RNA分子的方法，并將這些RNA分子用于制備治療乙型肝炎的藥物。將本發(fā)明得到的ldsRNA或siRNA以適當(dāng)?shù)谋壤c乙型肝炎病毒表達(dá)載體混合，并用尾靜脈液壓法注射到小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示非同源性序列l(wèi)dsRNA和siRNA基本不抑制乙型肝炎病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制，而與乙肝病毒基因同源性的ldsRNA和siRNA可以有效抑制乙型肝炎病毒在小鼠體內(nèi)的感染復(fù)制，抑制率高達(dá)90％以上。 |
| 國際公布 |
