| 公開(公告)號 | CN1320113C |
| 公開(公告)日 | 2007.06.06 |
| 申請(專利)號 | CN03129043.4 |
| 申請日期 | 2003.06.05 |
| 專利名稱 | 一種利用大腸桿菌發(fā)酵制備小干擾RNA分子的方法 |
| 主分類號 | C12N15/10(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/10(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 復(fù)旦大學(xué);上海復(fù)旦新楊生物科技有限責(zé)任公司;上海恒達(dá)科技發(fā)展股份有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 錢志康;宣寶琴;李 琳;徐劍鋒;譚 暢;閔太善;王維榮;謝承光;沈水源;程小偉;史順成;黃偉達(dá) |
| 地址 | 200433上海市邯鄲路220號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海正旦專利代理有限公司 |
| 代理人 | 陸 飛 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種制備RNAi用siRNA分子的方法，其特征在于包括構(gòu)建長鏈dsRNA表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，通過工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵，用堿-SDS法抽提發(fā)酵菌體得到全RNA和質(zhì)粒DNA的混合物；該混合物用CF-11柱進(jìn)行純化得到dsRNA；最后利用大腸桿菌RNase III將長鏈的dsRNA切成12-30bp的小干擾RNA；其中，構(gòu)建在大腸桿菌中表達(dá)長鏈dsRNA的表達(dá)載體的方法如下：(1)將目的基因片段以相反的方向?qū)⒒虻?’端連接到第三段DNA片段的兩側(cè)，然后克隆到帶有一個(gè)T7啟動(dòng)子的載體中去；當(dāng)把此表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到能表達(dá)T7 RNA聚合酶的宿主菌內(nèi)后，目的基因的正反兩個(gè)方向的DNA鏈以及兩者之間的第三段DNA鏈就能被依次轉(zhuǎn)錄，成為一條連續(xù)的RNA鏈；或者(2)利用帶有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，在合適的位置加入抗性基因和多克隆位點(diǎn)，并在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別加入方向相對的兩個(gè)啟動(dòng)子以及終止子，在多克隆位點(diǎn)中插入目的DNA片段后以正反兩個(gè)方向轉(zhuǎn)錄RNA。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種利用大腸桿菌發(fā)酵大規(guī)模制備RNA干擾用小干擾RNA分子的新方法。本發(fā)明構(gòu)建了長雙鏈RNA表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，通過大規(guī)模發(fā)酵，用堿-SDS法抽提發(fā)酵菌體得到全RNA和質(zhì)粒DNA的混合物。該混合物用CF-11柱進(jìn)行純化得到長雙鏈RNA。最后利用大腸桿菌Ⅲ型RNA酶將長雙鏈RNA切成12-30bp的小干擾RNA。得到的siRNA用分光光度法檢測其純度與濃度，OD260/OD280＝1.978，表明樣品的純度相當(dāng)高。每100g大腸桿菌菌體得到siRNA樣品約為210mg。 |
| 國際公布 |
