| 公開(公告)號 | CN1769435A |
| 公開(公告)日 | 2006.05.10 |
| 申請(專利)號 | CN200510038694.9 |
| 申請日期 | 2005.04.07 |
| 專利名稱 | 豬Ⅱ型圓環(huán)病毒重組腺病毒和疫苗 |
| 主分類號 | C12N7/01(2006.01)I |
| 分類號 | C12N7/01(2006.01)I;C12N15/861(2006.01)I;A61K39/235(2006.01)I;A61P31/12(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 姜 平;王先煒;李玉峰 |
| 地址 | 210095江蘇省南京市衛(wèi)崗1號南京農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處錢寶英 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 |
| 代理人 | 樓高潮 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 豬II型圓環(huán)病毒(PCV-2)重組腺病毒，是通過以下方法構(gòu)建而成的： (1)Cap蛋白基因的擴(kuò)增、克隆以GenBank中序號為AY181946的PCV2-TJ毒株基因序列為模板，用軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)一對引物，在兩條引物的5’端分別加入KpnI和HindIII酶切位點(diǎn)； 引物1：5’TTCggTACCAgCTATgACgTATCCAAg3’ 引物2：5’gCCAAgCTTTCACTTCgTCCTggTTTT3’ 以PCV-2感染的PK15細(xì)胞培養(yǎng)物中提取的DNA產(chǎn)物為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出了實(shí)驗(yàn)室分離毒株P(guān)CV-2的Cap蛋白全基因，該基因片段大小為751bp；通過這兩個設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把Cap基因克隆入穿梭載體pShuttle-CMV中，然后通過酶切和PCR鑒定，獲得含有Cap蛋白基因的穿梭載體pSH-ORF2； (2)含有Cap蛋白基因的穿梭載體pSH-ORF2與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組鑒定好的含有Cap蛋白基因的穿梭載體pSH-ORF2經(jīng)酶切線性化后與腺病毒骨架載體pAdEasy-1通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BJ5183中，在大腸桿菌重組酶的作用下，在腺病毒穿梭載體和腺病毒骨架載體之間發(fā)生同源重組，實(shí)現(xiàn)了把外源基因轉(zhuǎn)入腺病毒骨架載體，經(jīng)50μg/ml卡那霉素篩選獲得了含有外源基因的重組腺病毒質(zhì)粒； (3)重組腺病毒的獲得鑒定好的重組腺病毒質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293-A細(xì)胞，重組腺病毒質(zhì)粒在293細(xì)胞內(nèi)包裝成完整的重組腺病毒rAd-Cap。 |
| 摘要 | 本發(fā)明豬II型圓環(huán)病毒(PCV-2)重組腺病毒和疫苗屬于高新生物技術(shù)領(lǐng)域。通過PCR技術(shù)擴(kuò)增PCV-2編碼Cap蛋白的ORF2全基因序列，并把該基因序列克隆入腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體pShuttle-CMV中，與腺病毒載體系統(tǒng)的骨架載體pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-A細(xì)胞獲得了重組腺病毒并成功的進(jìn)行了噬斑純化，通過RT-PCR、間接ELISA、Western-blot和IPMA證明構(gòu)建成功表達(dá)了PCV-2Cap蛋白的重組腺病毒rAd-Cap。在該重組毒中可以使PCV-2的Cap蛋白獲得正確表達(dá)和表達(dá)量提高，從而能更有效的刺激機(jī)體的免疫保護(hù)反應(yīng)。 |
| 國際公布 |
