| 公開(公告)號(hào) | CN1285610C |
| 公開(公告)日 | 2006.11.22 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN03116665.2 |
| 申請(qǐng)日期 | 2003.04.29 |
| 專利名稱 | 人促肝再生因子衍生物及其表達(dá) |
| 主分類號(hào) | C07K14/475(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C07K14/475(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;A61K38/17(2006.01)I;A61P1/16(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué);上海唯科生物制藥有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 蔡在龍;毛積芳;賀雪峰;陳車生 |
| 地址 | 200433上海市楊浦區(qū)翔殷路800號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海新天專利代理有限公司 |
| 代理人 | 孫躍虹 |
| 國(guó)省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種人促肝再生因子衍生物的制備方法，該人促肝再生因子衍生物具有下述氨基酸序列： Gly Ser Met Arg Thr Gln Gln Lys Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp 1 5 10 15 Cys Pro Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly Arg His Ser Trp Ala Val Leu 20 25 30 His Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu Pro Thr Pro Glu Gln Gln 35 40 45 Gln Asp Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser Lys Phe Tyr Pro Cys 50 55 60 Glu Glu Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys Arg Asn His Pro 65 70 75 80 Asp Thr Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys His Leu His 85 90 95 Asn Glu Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys Ser Lys 100 105 110 Val Asp Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp， 115 120 125 其編碼相應(yīng)氨基酸的DNA序列為： ggatccatgc ggacgcagca gaagcgggac accaagttta gggaggactg cccgccggat 60 cgcgaggaac tgggccgcca cagctgggct gtcctccaca ccctggccgc ctactacccc 120 gacctgccca ccccagaaca gcagcaagac atggcccagt tcatacattt attttctaag 180 ttttacccct gtgaggagtg tgctgaagac ctaagaaaaa ggctgtgcag gaaccaccca 240 gacacccgca cccgggcatg cttcacacag tggctgtgcc acctgcacaa tgaagtgaac 300 cgcaagctgg gcaagcctga cttcgactgc tcaaaagtgg atgagcgctg gcgcgacggc 360 tggaaggatg gctcctgtga c 381， 其特征在于該人促肝再生因子衍生物采用的原核細(xì)胞大腸桿菌融合表達(dá)方法為： 1)提取胎肝總RNA 2)RT-PCR擴(kuò)增目的片段hALR cDNA 3)純化PCR產(chǎn)物 4)克隆目的片段至載體pGEM-T 5)重組質(zhì)粒的篩選和鑒定 6)PCR定點(diǎn)突變修復(fù) 7)質(zhì)粒DNA pGEM-T/hALR cDNA的BamHI、EcoRI雙酶切 8)凝膠回收hALR cDNA片段 9)hALR cDNA克隆于原核融合表達(dá)載體pGEX-4T-3形成pGEX-4T-3/hALR cDNA 10)轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá) 11)離心收集菌體 12)超聲破碎，離心，收集上清液 13)親和層析柱純化 14)收集目的峰，加入凝血酶酶切 15)酶切液65℃加熱，離心，收集上清，陰離子交換柱純化，凝膠過濾柱交換緩沖液，分裝、凍干；或 陰離子交換柱純化，凝膠過濾柱純化，分裝、凍干 16)體外、體內(nèi)活性測(cè)定。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及人促肝再生因子衍生物及其在大腸桿菌中的表達(dá)。本發(fā)明通過大腸桿菌原核融合表達(dá)系統(tǒng)，獲得具有天然活性，不含內(nèi)毒素，可大規(guī)模生產(chǎn)的重組人促肝再生因子衍生物。 |
| 國(guó)際公布 |
