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1.2.2 MTT法 肝癌HepG2細胞用0.25%胰酶處理制成單細胞懸液，以每孔約104個細胞接種于96孔板（每孔100 μL)。分別加入不同濃度的苦參堿溶液，使其終濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL，每個濃度設三個孔。然后在加培養(yǎng)液100 μL，每孔總體積為200 μL，同時設定空白孔及對照孔。然后放回CO2箱中培養(yǎng)24、36、48 h。分別在各個時間段結束前4 h加入MTT（5 mg/mL)溶液10 μL，反應4 h離心棄上清液。每孔加入DMSO 150 μL振蕩蕩5～10 min。用酶標儀測定波長為490 nm 的吸光值。根據(jù)公式計算：腫瘤細胞增值抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。
1.2.3 流式細胞術分析細胞周期 肝癌HepG2細胞以5×104/mL接種至6孔板中，細胞貼壁后，分別加入0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL的苦參堿，培養(yǎng)36 h后，收集細胞，并用流式細胞儀行細胞周期分析。
1.2.4 單磺酰戊二胺（ monodansylcadaverine， MDC)熒光染色 將DMEM液培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞以1×104/mL接種至12孔板中，待細胞貼壁后，分別加入0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦參堿，培養(yǎng)36 h棄培養(yǎng)液，用PBS液洗2遍，加入50 μmol/L MDC，37℃孵育10 min染色。再用PBS漂洗細胞3次，在熒光顯微鏡下觀察。
1.3統(tǒng)計學方法
采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用x±s表示，組間比較采用重復測量方差分析。檢驗水準（α)為0.05。多組間計量資料采用單因素方差分析檢驗；兩組間計量資料采用t 檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 苦參堿顯著抑制肝癌HepG2細胞的增殖
MTT測定結果見圖1，苦參堿顯著抑制肝癌HepG2細胞的增殖，并呈現(xiàn)時間-劑量依賴性。見表1�？鄥A0.5、1.0、2.0mg/mL 作用于肝癌HepG2細胞36 h后的抑制率分別：（17.21±2.02)%、（28.25±3.20)%、（38.77±5.58)%。
2.2流式細胞儀檢測結果
不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細胞36 h后，流式細胞儀分析細胞周期見表2。結果所示：不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細胞中36 h后，G1期細胞增多，S期細胞減少，呈現(xiàn)劑量依賴性。結果表明苦參堿將肝癌HepG2細胞阻滯在細胞周期的G1期。
2.3 MDC染色顯示苦參堿誘導肝癌HepG2細胞自噬的產生 醫(yī).學全.在.線網(wǎng)站www.gydjdsj.org.cn
為了研究苦參堿是否誘導了肝癌HepG2細胞自噬的產生，本文用熒光鏡觀察MDC染色的肝癌HepG2細胞，細胞顯著的形態(tài)學變化如圖2所示。MDC是自噬泡的特異性標記物熒光顯微鏡下觀察細胞時，胞質內可見到清晰的點泡狀結構，表明苦參堿誘導了自噬 的產生。
A～C：分別為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL濃度的苦參堿作用于肝癌HepG2細胞后，胞質內可見到大量MDC標記的自噬顆粒。箭頭所指為MDC標記的自噬泡 3 討論
原發(fā)性肝癌是惡性程度最高的腫瘤之一。全球男性發(fā)病率位于惡性腫瘤的第5位，死亡率居惡性腫瘤的第2位；全球女性發(fā)病率位于第7位，死亡率位 于第6位。全球每年新發(fā)肝癌約75萬人，而我國占半數(shù)以上[6]。由于肝癌具有惡性程度高、病情發(fā)展快、預后差、死亡率高等特點，多數(shù)就診時已屬晚期。目 前手術治療依然是肝癌的首選，但是肝癌發(fā)病隱匿， 確診時能手術者僅占l0%～15%，因此必須聯(lián)合其他非手術措施（如化療、生物治療等)進行綜合治療，才能有望提高肝癌患者的長期生存率[7]。近年來， 苦參堿作為一種新型化療藥物，具有療效顯著、副作用小、毒性低等特點應用于臨床。
苦參堿（Matrine)是中藥苦參、山豆根、苦豆子的主要活性成分，具有保護肝細胞、抗病毒、抗過敏等多種藥理作用[8]。此外苦參堿具有 廣泛的抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)：在體外實驗中苦參堿可明顯地誘導人乳腺癌[9]、骨肉瘤[10]及肝癌細胞[11]等的凋亡。苦參堿的抗腫瘤的作用機制很 多，主要包括誘導腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤細胞分化、誘導細胞自噬以及細胞毒等多種作用[3，12-13]。本實驗結果表明：苦參堿對人肝癌HepG2細胞 有明顯的抑制作用，不同濃度的苦參堿作用不同時間后，肝癌細胞的存活率降低，這種抑制作用呈時間和劑量依賴性。流式細胞儀分析細胞周期結果：苦參堿作用于 人肝癌HepG2細胞后， G1 期細胞數(shù)目明顯增多，S期細胞數(shù)目減少（P < 0.05)，這表明苦參堿作用肝癌細胞后將細胞周期阻滯在G1期，使細胞不能進入S期進行DNA合成，并最終抑制了肝癌HepG2細胞的抑制，本文實驗結 果與以往郭丹等[14]、夏寶妹等[15]、楊道科等[16]在肝癌、子宮內膜癌以及結腸癌細胞中的研究結果一致。同時熒光顯微鏡檢測：苦參堿誘導肝癌 HepG2細胞自噬泡的產生，這表明自噬參與了苦參堿抑制肝癌HepG2細胞的增殖，可能提示苦參堿作用于肝癌HepG2細胞后，自噬多發(fā)生在細胞周期的 G1期。而自噬作為一把雙刃劍，它與腫瘤之間的關系錯綜復雜，既可以促進腫瘤的生長，也可以誘導腫瘤的生長，在本實驗研究中認為它參與了苦參堿抑制肝癌細 胞的增殖。本文在既往研究的基礎上，探討了苦參堿對人肝癌HepG2增殖及其細胞自噬的影響，而其發(fā)生的信號通路及其作用機制仍需作進一步的研究。希望本 實驗研究能為細胞周期與腫瘤的增值、分化等之間的關系提供研究基礎，為臨床進一步更好的治療肝癌提供理論基礎。
