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1.2 儀器與方法
1.2.1 儀器與試劑： Master Cycler PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf，德國);Gel Doc2000凝膠圖像分析系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。限制性內(nèi)切酶Mse I(BioLabs. Inc.New England);Taq DNA酶和全血DNA提取試劑盒均為大連TaKaRa公司生產(chǎn)。
1.2.2 外周血白細(xì)胞基因組DNA提�。�4ml EDTA-Na2抗凝冰凍全血，按試劑盒說明分離提取其外周血白細(xì)胞基因組DNA，TE溶解后于-20℃保存。
1.2.3 PCR 擴(kuò)增： CTLA-4(318)C/T位點引物設(shè)計據(jù)文獻(xiàn)[2]，P1：5′GAAGGAT GGT GCTTCACAT 3′;P2： 5′ CTTTGCAGAAGACAGGGATGA 3′。引物由上海生工公司合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA模板2μl，10×Buffer 5μl，25mmol/L MgCl2 3μl，dNTP 4μl，引物(終濃度20μM)各0.5μl，Taq DNA酶2.0 U，加ddH2O至50μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min后再進(jìn)入循環(huán)，95℃變性20s，56 ℃退火30s,72 ℃延伸30s，共35個循環(huán)。末次循環(huán)后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物以1.5 %瓊脂糖凝膠100V電泳分離。
1.2.4 RFLP分析： 啟動子C/T多態(tài)性分析,反應(yīng)體系20μl，Mse I 1μl，10×NEB4緩沖液2μl，BSA 0.2μl，PCR 產(chǎn)物10μl，37 ℃溫浴過夜。產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，掃描成像同時進(jìn)行基因型鑒定。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間基因型頻率、等位基因頻率的比較用行×列χ2檢驗，顯著性檢驗水平為P<0.05。
2 結(jié)果
2.1 酶切結(jié)果：含SNP-318(C/T)位點的PCR擴(kuò)增片段長度為247bp，經(jīng)MseΙ消化后基因型CC產(chǎn)生226bp和21bp兩種片段;基因型CT產(chǎn)生226bp、130bp、96bp、21bp4種片段;基因型TT產(chǎn)生130bp、96bp、21bp 3種片段。其中21bp片段小,難以分辨，見圖1(目錄后)。
2.2 各組CTLA-4(318)基因型及等位基因頻率比較：61例GD患者和79例正常對照(NC) 啟動子基因型及等位基因頻率見表1。對兩群體基因型進(jìn)行遺傳平衡的χ2檢驗(GD組χ2=0.05，P=0.82;對照組χ2=0.04，P=0.84)，基因型頻率分布均具有群體代表性。 GD患者CTLA-4基因啟動子318C/T位點基因型與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，同樣等位基因頻率亦無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。表1 GD患者和正常對照CTLA4基因SNP-318C/T位點基因型及等位基因頻率的比較注：GD組和對照組基因型比較，^χ2=1.80， P=0.18;等位基因頻率比較^^χ2=1.04，P=0.31
3 討論
CTLA-4位于人類染色體2q33，與CD28一樣，是一種細(xì)胞跨膜分子，參與T細(xì)胞的調(diào)節(jié)。T細(xì)胞的應(yīng)答、活化至少需要兩種信號。其中第2信號即“共刺激信號”，由T細(xì)胞表面的CD28和APC表面的B7分子相互作用提供。CTLA-4與CD28競爭B7配體，向T細(xì)胞傳遞負(fù)性信號，對T細(xì)胞增殖具抑制性調(diào)節(jié)作用，可引起T細(xì)胞凋亡。而CTLA-4基因的多態(tài)性可能通過改變CTLA-4蛋白的表達(dá)或功能而導(dǎo)致個體自身免疫性疾病的發(fā)生，表明CTLA-4基因或許是自身免疫性疾病的普遍易感性基因。GD是一種自身免疫性疾病，T細(xì)胞應(yīng)答在GD發(fā)病過程中起重要作用，CTLA-4基因突變可能影響CTLA-4與B7親和力，削弱其對T細(xì)胞的抑制作用，導(dǎo)致T細(xì)胞異�；罨鸺膊�。CTLA-4基因SNP-318C等位基因較T等位基因有更高的促進(jìn)細(xì)胞活化的作用，攜帶T等位基因時在刺激細(xì)胞表面有CTLA-4的高表達(dá)，在靜止細(xì)胞表面有CTLA-4mRNA的表達(dá)增加,從而影響CTLA-4的水平[3-5]。
