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3 討 論
關(guān)節(jié)軟骨沒有血液供應(yīng)和神經(jīng)支配，損傷后自身修復能力有限，許多學者嘗試用組織工程化軟骨來修復關(guān)節(jié)缺損，獲得了較為滿意的效果，修復組織主要為透明樣軟骨。但是新生軟骨的功能差于正常關(guān)節(jié)軟骨，這可能是由于新生軟骨組織尚未達到正常關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)和生物化學性能，而軟骨基質(zhì)是軟骨特有生理功能的基礎(chǔ)，所以臨床上要想重建關(guān)節(jié)軟骨，恢復關(guān)節(jié)的功能，修復軟骨組織基質(zhì)分子代謝的機制研究就顯得很重要。本實驗應(yīng)用4種單克隆抗體3-B-3(-)、MMPs、BC-4、BC-13，初步探討組織工程修復軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖的代謝及兩種相關(guān)調(diào)節(jié)酶MMPs和aggrecanases的作用。
蛋白聚糖是軟骨基質(zhì)的主要成分之一，填塞于Ⅱ型膠原所構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，單體由一條核心蛋白與一至上百條氨基聚糖鏈組成。蛋白聚糖含有許多酸性基團，能吸納大量的水分，從而保證關(guān)節(jié)軟骨良好的黏彈性，完成抵抗壓力的功能醫(yī).學.全.在.線gydjdsj.org.cn。
3-B-3(-)是指在利用3-B-3作為一抗孵育前，不用硫酸軟骨素ABC酶對樣本進行預(yù)處理。3-B-3(-)識別的位點是一個由飽和的己糖醛酸和一個N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成的二糖單位，該位點位于完整的CS鏈末端，在有3-B-3(-)表達的地方，說明此處存在有新合成的蛋白聚糖。利用3-B-3(-)進行的一系列研究發(fā)現(xiàn)：其主要表達于未成熟和處于生長、重構(gòu)期的關(guān)節(jié)軟骨組織，正常成年關(guān)節(jié)軟骨肥大細胞區(qū)[5]。3-B-3(-)的表達常被視為蛋白聚糖合成的標志，在修復軟骨組織中，新合成蛋白聚糖意味著軟骨細胞試圖修復、重塑軟骨組織。本研究中修復組織3-B-3(-)表達位于修復組織中下層，顯示修復組織合成新的蛋白聚糖。
MMPs和aggrecanases是調(diào)控軟骨細胞外基質(zhì)蛋白聚糖代謝最主要的兩種酶。MMPs降解蛋白聚糖時最重要的裂解位點位于核心蛋白(interglobulin domain, IGD)Asn341～Phe342之間，酶切這一肽鍵可以產(chǎn)生C-末端序列為VDIPEN的新表位，是 BC-4特異性的識別位點;aggrecanases降解蛋白聚糖時最重要的裂解位點位于IGD區(qū)Glu373～Ala374之間，酶切這一肽鍵可以產(chǎn)生C-末端序列為NITEGE的新表位，可以被BC-13特異性識別[12]。研究顯示在人的軟骨組織代謝中，MMPs和aggrecanases兩種酶在正常關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)蛋白聚糖的基礎(chǔ)代謝、軟骨損傷蛋白聚糖的降解以及修復軟骨組織重塑中都具有重要作用[13-14]。但在動物體內(nèi)外實驗研究顯示，MMPs和aggrecanases在基質(zhì)蛋白聚糖代謝中的作用不同。
體外培養(yǎng)兔[15]、豬[16]的軟骨組織發(fā)現(xiàn)，aggrecanases降解片段表達陰性，而MMPs降解片段表達陽性，當用炎性因子IL-1刺激后，aggrecanases活性明顯增強，降解片斷增加，而MMPs活性表達不變，或改變不明顯。鼠關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中aggrecanases的降解片段表達明顯增加，而敲除aggrecanases基因，可以明顯減輕或阻止鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[17-19]。以上結(jié)果顯示MMPs 在基質(zhì)蛋白聚糖的基礎(chǔ)代謝中起重要作用，而aggrecanases的主要作用是在軟骨受到損傷時降解蛋白聚糖。本實驗中，MMPs及其降解片段BC-4在體內(nèi)修復組織和正常軟骨組織表達陽性，而aggrecanases的降解片段BC-13表達陰性，顯示MMPs在兔軟骨基質(zhì)蛋白聚糖基礎(chǔ)代謝以及修復重塑中起重要作用，與文獻報道一致，而aggrecanases主要作用是在軟骨受到損傷時降解蛋白聚糖[15，20]。
關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)組成，軟骨細胞合成并分泌蛋白聚糖和膠原在內(nèi)的多種基質(zhì)成分，同時也合成多種降解基質(zhì)的酶。生理情況下，成熟軟骨組織細胞外基質(zhì)的合成和分解之間相互制約，相互作用，維持著代謝的動態(tài)平衡，從而保證軟骨組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性[2，21]。在骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)及急性關(guān)節(jié)損傷等病理狀態(tài)下，這種動態(tài)平衡被打破，各種損傷因素可以引起腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白細胞介素1(interleukin-1, IL-1)升高，組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMP)和ɑ-2巨球蛋白(ɑ-2 macroglobulin, ɑ2M)表達下降，MMPs和aggrecanases表達增加，活性增強，細胞外基質(zhì)蛋白聚糖和膠原分解大于合成，關(guān)節(jié)軟骨受損，功能減弱[22-23]。
在關(guān)節(jié)軟骨損傷過程中蛋白聚糖與膠原的代謝變化以及和相關(guān)調(diào)節(jié)分子之間的關(guān)系已有了一定的了解，而在修復過程中這些分子的表達狀況及其關(guān)系研究的很少。FRISBIE[24]和BARNEWITZ[25]用構(gòu)建的組織工程軟骨移植修復關(guān)節(jié)骨軟骨缺損，在缺損處形成透明樣軟骨，但是修復組織質(zhì)量差于正常關(guān)節(jié)軟骨。軟骨組織代謝比較慢，修復的軟骨組織是否會隨著時間的推移發(fā)生重塑，接近或達到正常關(guān)節(jié)軟骨的生物性能?要回答上面的問題，軟骨修復過程中基質(zhì)分子代謝機制的研究就很重要。JAMES等[26]體外構(gòu)建的組織工程軟骨，在生理機械力作用下IL-1、MMP-1、aggrecanases等表達下降，轉(zhuǎn)化生長因子-β表達上升，膠原和糖氨聚糖合成增加。根據(jù)相關(guān)研究[26-27]推測，在軟骨修復過程中，參與細胞外基質(zhì)合成代謝的大分子(TIMP、ɑ2M等)表達增多、活性增強，而參與分解代謝的大分子(MMPs、aggrecanases等)則相對表達降低、活性減弱，膠原和蛋白聚糖合成大于分解，才能修復軟骨缺損。在本研究中，軟骨修復組織蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)表達增加，而MMPs及其降解表位BC-4表達降低，修復組織合成代謝大于分解代謝，修復損傷的軟骨組織，這與生長期軟骨組織的合成代謝大于分解代謝相似[2]。軟骨組織代謝比較慢，隨著時間的推移修復軟骨組織的合成與分解代謝是否會達到平衡，是否會成功重塑、再生損傷的軟骨，使其接近或達到正常關(guān)節(jié)軟骨還需要做進一步的長期研究。
