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1 材料與方法
1.1 主要實驗儀器和材料
新西蘭兔(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)，光學顯微鏡(Nikon，日本)，熒光顯微鏡(Olympus，日本)，DMEM-F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記山羊抗小鼠IgG(Gibco，美國)，胎牛血清(北京，元亨圣馬)，正常山羊封閉血清液、DAB顯色液、山羊抗小鼠IgG-HRP(北京中山金橋)，碘化丙啶(Sigma，美國)，MMP(Chemicon, 美國)，硫酸軟骨素酶ABC、單克隆抗體3-B-3、BC-4、BC-13 (英國加的夫大學Bruce Caterson教授提供)。
1.2 松質(zhì)骨骨基質(zhì)明膠的制備
取4～5月齡新西蘭兔長骨干骺端以及髂骨處松質(zhì)骨，按文獻[9]方法制備松質(zhì)骨骨基質(zhì)明膠(bone matrix gelatin, BMG)。將制備的松質(zhì)骨修成直徑約3mm、厚3mm的圓柱狀，環(huán)氧乙烷滅菌后存于-30℃?zhèn)溆谩?/P>
1.3 組織工程軟骨移植修復膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損
取28d新西蘭幼兔1只，無菌條件下分離肱骨、股骨和脛骨關(guān)節(jié)面軟骨，體外單層原代培養(yǎng)[10]后收集細胞，制成107/mL的細胞懸液，按106/管接種到已經(jīng)放有松質(zhì)骨BMG的10mL離心管內(nèi)，靜置2h后加入4mL含150mL/L胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周后移植修復兔股骨內(nèi)側(cè)髁骨軟骨缺損(直徑3mm，深3mm;n=6)，術(shù)后兔子籠內(nèi)自由活動。
1.4 組織學染色
手術(shù)后6個月取股骨髁修復組織標本，甲醛溶液固定24h，EDTA脫鈣1月左右，系列乙醇脫水，石蠟包埋，5μm切片，進行蘇木蘇-伊紅(HE)、甲苯胺蘭(TB)、天狼猩紅、蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs降解表位BC-4、aggrecanases降解表位BC-13的染色。
1.4.1 3-B-3(-)、BC-13、BC-4免疫熒光染色
石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。于2mL/L Triton X-100室溫下25min;加入0.1u硫酸軟骨素酶ABC 37℃孵育45min(3-B-3無此步驟);加50mL/L山羊正常血清封閉液以消除非特異性染色，室溫45min，吸去多余液體，不洗;滴加一定比例稀釋的一抗(3-B-3、BC-13、BC-4)，4℃過夜(18h以上);37℃復溫45min后加入1∶100稀釋的FITC標記的二抗，37℃孵育45min;加碘化丙啶復染細胞核，5min。上述各步間均用PBS緩沖液浸洗3次，每次5min。碳酸鹽-甘油封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.4.2 MMPs免疫組織化學染色
石蠟切片，常規(guī)脫蠟和水化后，2mL/L Triton X-100室溫25min;3mL/L H2O2(甲醛配制)室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;1g/L胰蛋白酶37℃濕盒孵育30min;50mL/L山羊正常血清封閉液37℃ 45min，吸去多余液體，不洗;滴加1∶1000稀釋的MMP單克隆抗體，4℃過夜(大于18h);37℃復溫45min后加入1∶100稀釋的HRP標記的二抗，37℃孵育45min。上述各步間均用PBS緩沖液浸洗3次，每次5min。滴加新鮮配制的DAB，室溫顯色10min，蒸餾水洗。蘇木素復染，水性封片劑封片，光學顯微鏡下觀察。
2 結(jié) 果
2.1 形態(tài)學觀察
松質(zhì)骨BMG復合軟骨細胞移植體內(nèi)修復同種異體兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損，術(shù)后6個月肉眼觀察顯示修復組織與周圍正常軟骨已愈合，修復組織表面基本平整，顏色與周圍正常軟骨組織近似(圖1A)。HE染色顯示修復交界區(qū)整合良好，不易辨認。修復組織為透明樣軟骨組織，深層細胞柱狀排列，軟骨細胞存在軟骨陷窩內(nèi)，重建了軟骨下骨板(圖1B)�；|(zhì)染色顯示修復組織基質(zhì)蛋白聚糖(圖1C)和膠原(圖1D)表達接近周圍正常軟骨，分布均勻。
2.2 蛋白聚糖代謝改變
修復組織中下層3-B-3(-)表達陽性，細胞漿染成綠色，顯示修復組織合成新的蛋白聚糖(圖2A)。BC-13在修復組織和周圍正常軟骨染色都為陰性(圖2C)。MMPs主要存在于修復組織的中下層，部分細胞質(zhì)染成棕黃色(圖2D)。MMPs裂解表位BC-4染色陽性，細胞質(zhì)染成綠色，中下層染色重(圖2F)。
