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1 材料與方法
1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3由復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院豐有吉教授惠贈(zèng)。6周齡BALB/C雌性裸鼠12只由南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室進(jìn)行。
1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 主要試劑：RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司，鼠抗人CD34單克隆抗體一抗，兔抗人單克隆抗體MMP2購自博士德公司，山羊抗兔生物素標(biāo)記二抗購自DAKO公司，ABC免疫組化試劑盒購自華美生物工程有限公司。
1.3 裸鼠腹腔移植瘤模型的建立 SKOV3細(xì)胞懸液注射于12只裸鼠腹腔(每只3 ×106個(gè)細(xì)胞)，待裸鼠腹水顯著、接近死亡時(shí)處死裸鼠，取出腹腔移植瘤組織及腫瘤周邊組織。10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。
1.4 CD34/PAS雙重染色 所收集的組織標(biāo)本制片后二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，組織抗原微波修復(fù)，10%羊血清封閉1∶100鼠抗人CD34單克隆抗體一抗，室溫孵育2小時(shí)生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體，HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素，DAB反應(yīng),顯微鏡下觀察到內(nèi)皮細(xì)胞著色后, 終止顯色反應(yīng)，0.5%高碘酸溶液還原8~10 min，Schiff液染色10 min，蒸餾水返色, 蘇木精對比染色，顯微鏡下觀察。
1.5 免疫組化 石蠟標(biāo)本二甲苯脫蠟，酒精梯度水化，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，組織抗原微波修復(fù)，10%羊血清封閉1∶100鼠抗人MMP-2單克隆抗體一抗,室溫孵育2 h，生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體，室溫30 min，HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素，DAB反應(yīng)顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：以鼠的IgG代替一抗作為陰性對照。細(xì)胞核和(或)細(xì)胞漿呈淡黃色、黃色、棕黃色顆粒為陽性。兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行盲法讀片，按Formwitz半定量積分法，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比：≤5%計(jì)0分;~25%計(jì)1分;~50%計(jì)2分;~75%計(jì)3分;>75%計(jì)4分。細(xì)胞染色強(qiáng)度：無色計(jì)0分;淡黃色計(jì)1分;黃色計(jì)2分;棕黃色計(jì)3分。兩者相乘即是最后結(jié)果：0分為陰性(-);1～4分為弱陽性(+);5～8分為陽性(++);9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。
2 結(jié) 果
2.1 裸鼠腹腔移植瘤鏡下觀察 處死荷瘤鼠, 腹腔內(nèi)見1~2 ml血性腹水，腫瘤呈實(shí)性，彌漫性生長, 直徑大小0.5~1.5 cm不等, 浸潤腸肝脾等腹腔臟器醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn。
2.2 CD34/PAS雙重染色 取卵巢癌腹腔移植瘤中央?yún)^(qū)域組織行CD34/PAS雙重染色，結(jié)果顯示部分腫瘤細(xì)胞灶性表達(dá)PAS陽性物質(zhì)，部分PAS陽性物質(zhì)將腫瘤細(xì)胞同管腔分隔，腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的管腔結(jié)構(gòu)中沒有CD34陽性的內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，管腔結(jié)構(gòu)中可見紅細(xì)胞。見圖1。
2.3 MMP2在卵巢癌腹腔移植瘤中央?yún)^(qū)域和邊緣區(qū)域組織的表達(dá) MMP2陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要分布于細(xì)胞漿中。裸鼠卵巢漿液性腺癌腹腔移植瘤中有MMP2表達(dá)。MMP2蛋白在裸鼠卵巢癌腹腔移殖瘤中央?yún)^(qū)域表達(dá)-~++ 3例，+++ 9例(75.0%);邊緣區(qū)域表達(dá)-~++ 10例，+++ 2例(16.7%)，MMP2蛋白陽性表達(dá)率在腫瘤中央?yún)^(qū)域組織比腫瘤邊緣區(qū)域明顯增高(P<0.05 )，圖2、3。
2.4 MMP2-mRNA在卵巢癌腹腔移植瘤中央和邊緣區(qū)域組織的表達(dá) RT-PCR分析顯示卵巢癌腹腔移植瘤腫瘤細(xì)胞表達(dá)MMP2, 腫瘤組織中央?yún)^(qū)域MMP2表達(dá)相對值(0.764±0.026)與邊緣區(qū)域(0.483±0.039)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。
3 討 論
少數(shù)高度惡性腫瘤在沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞的參與下，腫瘤細(xì)胞表型出現(xiàn)轉(zhuǎn)化，通過自身變形直接形成特有的微循環(huán)管道，被稱為血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)。這種擬態(tài)血管的管壁結(jié)構(gòu)與血管生成不一樣，無血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆。VM是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于部分高度惡性腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌等內(nèi)的一種新的腫瘤血液供應(yīng)方式。高度惡性的腫瘤細(xì)胞在快速生長期間，通過腫瘤血管生成所形成的內(nèi)皮依賴性血管無法滿足其血液供應(yīng)的需要時(shí)，腫瘤細(xì)胞可以通過血管生成擬態(tài)這種微循環(huán)管道來獲取營養(yǎng)，使得腫瘤具有高度侵襲性。
美國Iowa大學(xué)的Maniotis等研究高侵襲性葡萄膜黑色素瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)：直徑>1 cm的腫塊很少壞死，但是普通病理切片上難以見到由血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的新生血管;PAS染色可見多種陽性管道結(jié)構(gòu)，無內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，腫瘤細(xì)胞模仿機(jī)體血管形成脈管，和原有靜脈連接，有的管道可見紅細(xì)胞。孫保存[4]等通過CD31和PAS雙重染色來觀察黑色素瘤內(nèi)血管生成擬態(tài)的形態(tài)學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)CD31染色陰性的腫瘤細(xì)胞可圍成管腔，內(nèi)襯櫻桃紅色的PAS陽性物質(zhì),管腔內(nèi)有成堆的紅細(xì)胞;也有些血管生成擬態(tài)中腫瘤細(xì)胞圍成的不規(guī)則管腔內(nèi)無PAS陽性物質(zhì)襯復(fù),管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞，但部分黑色素瘤細(xì)胞能夠表達(dá)PAS陽性物質(zhì)。
