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2.3.1 對(duì)照組SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況
對(duì)照組于第1、5、8天檢測(cè)AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)情況。在共培養(yǎng)開始第1天，可檢測(cè)到AQP5的mRNA表達(dá)，但AQP5的表達(dá)比較弱，不同時(shí)間段差異不明顯，而在不同時(shí)間段SP-C都沒有表達(dá)(圖5)。
2.3.2 實(shí)驗(yàn)組A SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況
實(shí)驗(yàn)組A所檢測(cè)到的SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況與對(duì)照組觀察結(jié)果相似(圖6)。
2.3.3 實(shí)驗(yàn)組B不同時(shí)間段SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況
實(shí)驗(yàn)組B在共培養(yǎng)的各時(shí)間段可同時(shí)檢測(cè)到AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)(圖7，圖8)。
2.3.4 不同實(shí)驗(yàn)處理組中AQP5和SP-C mRNA的表達(dá)量的比較
對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A各時(shí)間點(diǎn)均未見SP-C mRNA的表達(dá)，而在實(shí)驗(yàn)組B于共培養(yǎng)的第1、5、8天的SP-C mRNA的表達(dá)量分別為1599.00±158.95、2066.80±101.30、3893.00±178.60。不同處理組的AQP5 mRNA的表達(dá)量見表1。實(shí)驗(yàn)組B各時(shí)間點(diǎn)AQP5 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組比較，AQP5 mRNA的表達(dá)量明顯增多(F=78.61，P<0.01)，而與實(shí)驗(yàn)組A的AQP5 mRNA的表達(dá)量比較，也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=67.38，P<0.01)。但是，實(shí)驗(yàn)組A各時(shí)間點(diǎn)則與對(duì)照組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.45，P>0.05)。表1 不同處理組AQP5mRNA的表達(dá)量的比較(略)
3 討 論
AECⅡ具有分泌肺泡表面活性物質(zhì)、調(diào)節(jié)肺泡表面張力、維持肺液體平衡和多種防御功能，不僅可以修復(fù)肺泡的正常結(jié)構(gòu)，更可以有效地恢復(fù)功能，從而阻止和修復(fù)肺損傷[5]。因此，體外或者體內(nèi)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為AECⅡ一直是肺損傷修復(fù)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。研究表明，SP-C是AECII細(xì)胞表達(dá)的特征性蛋白，AECⅡ細(xì)胞可能是AECI的祖細(xì)胞，當(dāng)AECⅡ可以轉(zhuǎn)化為AECI后，獲得AECI的表型特征AQP5，同時(shí)失去AECⅡ的表型標(biāo)志SP-C[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用SP-C和AQP5兩個(gè)特異性蛋白來(lái)鑒定干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肺泡上皮細(xì)胞的效果。
本實(shí)驗(yàn)建立的懸掛式體外非接觸共培養(yǎng)小室，當(dāng)MSCs單獨(dú)靜置培養(yǎng)時(shí)，或者與正常肺組織單細(xì)胞懸液共同培養(yǎng)時(shí)，在共培養(yǎng)的全部時(shí)段，都未檢測(cè)到AECⅡ表達(dá)的特征性蛋白SP-C的表達(dá)，說(shuō)明干細(xì)胞都沒有轉(zhuǎn)換為AECⅡ或者轉(zhuǎn)化為AECⅡ細(xì)胞的數(shù)量非常少。該兩種情況下都有AQP5的表達(dá)。而且，AQP5的表達(dá)量也沒有變化。KOTTON[7]及其同事的研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的MSCs可表達(dá)AECI的特異性標(biāo)記物AQP5，這種細(xì)胞亞型可能是肌細(xì)胞、骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞。推測(cè)所檢測(cè)到的AQP5表達(dá)是MSCs自身表達(dá)的結(jié)果，MSCs沒有向AECI分化。而損傷肺組織與MSCs共培養(yǎng)時(shí)，不但有SP-C的表達(dá)，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增加，說(shuō)明MSCs成功轉(zhuǎn)換為AECⅡ;同時(shí)，AQP5表達(dá)量明顯高于實(shí)驗(yàn)組A和對(duì)照組。我們推斷AQP5表達(dá)量增加部分是由AECⅡ細(xì)胞轉(zhuǎn)化為AECI細(xì)胞引起的或是MSCs直接分化為AECI。這與文獻(xiàn)報(bào)道的用博來(lái)霉素導(dǎo)致小鼠肺損傷時(shí)，靜脈注射外源性的MSCs，在受體小鼠肺中，比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前，MSCs總的DNA的含量升高23倍，同時(shí)AECⅡ的含量升高3倍的研究結(jié)果一致[8]醫(yī)學(xué)全.在線gydjdsj.org.cn。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，在不同的環(huán)境、不同的培養(yǎng)液中可以分化為多種細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等[9]。一種理論認(rèn)為組織及器官損傷可以被干細(xì)胞感知，遷移到損傷部位并分化為器官特異的細(xì)胞，以修復(fù)損傷器官的結(jié)構(gòu)和功能[10]。本研究通過非接觸共培養(yǎng)，采用聚碳酸脂膜將損傷肺組織與干細(xì)胞分開，使損傷肺組織細(xì)胞不能通過，而細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以自由通過，成功建立了體外非接觸共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肺泡上皮細(xì)胞的模型，驗(yàn)證了該理論的正確性。研究報(bào)道，之所以損傷細(xì)胞能夠誘導(dǎo)MSCs分化為損傷特異性的細(xì)胞，可能是因?yàn)閾p傷細(xì)胞分泌的特殊的細(xì)胞因子刺激MSCs或者是損傷細(xì)胞激活某個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)[2]。本研究中MSCs分化為肺泡上皮細(xì)胞的具體機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。
采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞替代治療、基因治療以及組織器官的再造中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。骨髓采集方便、安全、損傷小，供者無(wú)明顯并發(fā)癥，有利于體外擴(kuò)增和自體回植。本研究成功建立了體外誘導(dǎo)MSCs分化為肺泡上皮細(xì)胞的模型，有望為臨床建立永不枯竭的肺細(xì)胞和組織來(lái)源，以修復(fù)和取代受損傷的肺組織和細(xì)胞，為根本性治療肺損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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