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小鼠頸椎脫臼處死后，放入750mL/L的酒精內(nèi)浸泡5min。無菌條件下取出雙側(cè)股骨，去除附帶組織，兩端剪斷暴露骨髓腔。用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液及1號(hào)針頭反復(fù)沖洗，將骨髓腔內(nèi)的骨髓沖出，并用1號(hào)針頭反復(fù)抽吸，制成單細(xì)胞懸液，充分混勻，轉(zhuǎn)入離心管，1500r/min離心5min棄上清及脂肪層，沉淀用DMEM培養(yǎng)液充分混勻，用吸管輕輕疊加到密度為1.077g/mL的Ficoll-Paque分離液上，2500r/min離心10min，取界面層的單核細(xì)胞，再用DMEM培養(yǎng)液多次洗滌，離心后備用。細(xì)胞沉淀以5×105個(gè)/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶，加入DMEM完全培養(yǎng)液置于37℃，50mL/L CO2，80%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中，2d后全量換液，去除未貼壁的細(xì)胞，以后每隔3d換液1次，倒置相差顯微鏡逐日觀察細(xì)胞的形態(tài)，貼壁情況及生長情況。待細(xì)胞融合達(dá)80%，胰酶37℃消化，進(jìn)行傳代、擴(kuò)增培養(yǎng)。取培養(yǎng)第2代的細(xì)胞用PBS洗滌3次，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液移入離心管，1500r/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀PBS洗滌3次，分別加入熒光標(biāo)記的抗體，4℃孵育30min，PBS洗去未標(biāo)記抗體，10g/L多聚甲醛固定，應(yīng)用FACScan流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原表達(dá)。
1.3 建立體外非接觸共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/P>
參照本實(shí)驗(yàn)室的方法建立小鼠肺損傷模型[4]，并參照POPOV等[3]方法建立體外非接觸共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，�?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛨D見圖1。無菌條件下分離提取無肺損傷肺組織(共25只小鼠)、肺損傷模型肺組織(共25只小鼠)。制備肺組織單細(xì)胞懸液。將約5×104個(gè)/mL的小鼠肺細(xì)胞接種于0.4μm孔徑(Millpore)大小的膜上(懸掛式體外共培養(yǎng)小室)，并放入24孔板中，在24孔板的底部同時(shí)放上適當(dāng)大小的載玻片，并接種約5×104個(gè)/mL小鼠骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。共設(shè)計(jì)三組，每組6孔：對(duì)照組：MSCs單獨(dú)靜置培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)組A： 正常健康肺組織單細(xì)胞懸液(上室)+MSCs(下室);實(shí)驗(yàn)組B：損傷組肺組織單細(xì)胞懸液(上室)+MSCs(下室)細(xì)胞。共同培養(yǎng)8d，每日倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，貼壁情況及生長情況。
1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測表面蛋白C(surfatcant protein C, SP-)和水通道蛋白5(aquaporin protein 5, AQP-5)的熒光表達(dá)醫(yī)學(xué)全.在線gydjdsj.org.cn
在共培養(yǎng)的第8天，根據(jù)以下步驟處理細(xì)胞標(biāo)本：①將共培養(yǎng)中接種有MSCs的載玻片取出，40g/L的多聚甲醛固定10min，0.01mol/L PBS漂洗3～5次;②在同一培養(yǎng)皿中分別加入PBS稀釋抗-SP-C(1∶100)一抗和抗-AQP5(1∶100)，濕盒內(nèi)4℃孵育24h，0.01mol/L PBS漂洗3次;③加入FITC標(biāo)記和TRITC標(biāo)記的抗兔IgG(1∶100)，37℃孵育2h，0.01mol/L PBS漂洗3次;④0.01mol/L PBS充分洗滌后加入終濃度為10mg/L Hoechst 33342約1mL，室溫孵育20min;以抗體稀釋液代替單克隆抗體作為陰性對(duì)照試驗(yàn)。⑤0.01mol/L PBS充分洗滌后用VECTASHIELD Mounting Medium封片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察SP-C、AQP5的熒光表達(dá)情況。
1.5 RT-PCR 檢測非接觸共培養(yǎng)體系模型下室中的SP-C和AQP5 mRNA
1.5.1 總RNA的提取
RNA抽提試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，具體操作按照試劑盒說明書。
1.5.2 cDNA第一鏈合成反應(yīng)
20μL反應(yīng)體積中含2μL 10×PCR buffer、2μL 2mmol/L dNTP、4μL 25mmol/L MgCl2、0.5μL RNase抑制劑、2μL RNA模板、1μL oligo dT引物、7.5μL無RNase水，反應(yīng)條件為：50℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。
1.5.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)
通過對(duì)AQP-5和SPC基因組DNA序列分析，用計(jì)算機(jī)輔助生物軟件Primer 5.0(Applied Biosystem, Inc.Co.)設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，AQP-5:Forward(5′-3′)：TGTCGTCGTGGTGATTGTA;Reverse(5′-3′)：ACTGTGCCCTTCTTCCTG。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長為355bp;SPC：Forward(5′-3′)：GAGCCAGTTTCGCATTCC;Reverse(5′-3′)：CAGGTCTCGCCCAGAAGA。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長為463bp。引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系包括：每種dNTP 250μmol/L，MgCl2 2.5μmol/L，10×PCR緩沖液5μL，Taq酶5u，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3μL，引物0.1μmol/L/條，終反應(yīng)體系50μL。PCR反應(yīng)在PX-2型PCR儀上進(jìn)行，AQP-5循環(huán)條件為：95℃ 10min;94℃ 60s，48℃ 90s，72℃ 60s，35個(gè)循環(huán);72℃ 10min。SPC循環(huán)條件為：95℃ 10min;94℃ 60s，50℃ 90s，72℃ 60s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。取5μL產(chǎn)物經(jīng)12g/L瓊脂糖電泳，鑒定產(chǎn)物的特異性。最后將所獲得的PCR產(chǎn)物利用GeneTools(SynGene公司，版本：3.07)進(jìn)行產(chǎn)物量的測定(豐度圖結(jié)果未顯示)。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均數(shù)之間比較采用General Lineral Model(GLM)模型進(jìn)行析因多因素方差分析，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、純化、擴(kuò)增和鑒定
骨髓單核細(xì)胞懸液接種于塑料培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底散在分布，呈圓形，48h后完全換液，去除未貼壁的血細(xì)胞。此時(shí)貼壁的細(xì)胞為單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞的克隆，細(xì)胞形態(tài)均一，為長梭形。培養(yǎng)至10～12d，細(xì)胞接近融合，每個(gè)克隆約數(shù)百至數(shù)千個(gè)細(xì)胞，集落之間細(xì)胞出現(xiàn)重疊，細(xì)胞形態(tài)均一，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，旋渦中心的細(xì)胞可形成多細(xì)胞層，細(xì)胞界限不清，黏附于貼壁細(xì)胞之上的雜細(xì)胞在換液的過程中逐漸被清除。傳代后的MSCs增殖生長仍然迅速，生長潛伏期較短，7～10d即達(dá)到完全融合(圖2)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示二代細(xì)胞均一性在95%以上，CD34、CD45表達(dá)為陰性，證明這一類細(xì)胞為非造血類細(xì)胞。CD105、CD106表達(dá)陽性(圖3)。
2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測SP-C和AQP5的熒光表達(dá)
于共培養(yǎng)的第8天處理標(biāo)本，然后用激光共聚焦觀察各處理組共培養(yǎng)下室中的免疫熒光表達(dá)情況。對(duì)照組只檢測到MSCs的藍(lán)色熒光和AQP5的紅色熒光(圖4A)。實(shí)驗(yàn)組A也只檢測到MSCs的藍(lán)色熒光和AQP5的紅色熒光(圖4B)。實(shí)驗(yàn)組B可同時(shí)檢測到MSCs的藍(lán)色熒光，AQP5的紅色熒光，以及綠色的SP-C的熒光(圖4C、圖4D)。
2.3 共培養(yǎng)體系下室中的SP-C和AQP5 mRNA的表達(dá)情況
