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1.2.4 MSC生長曲線測定：取P3代細胞制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至4×107/L，接種于24孔培養(yǎng)板(每孔200μL，37℃,體積分數(shù)為5% CO2的飽和濕度環(huán)境)培養(yǎng)，每3 d換液1次。從第2天起每隔24 h計數(shù)3孔細胞數(shù)，取其平均值作為當(dāng)天細胞數(shù)，以細胞數(shù)為縱坐標(biāo)，天數(shù)(8d)為橫坐標(biāo)，繪制細胞生長曲線。
1.2.5 MSC增殖能力鑒定：分離5×106個骨髓單個核細胞為起始在體外培養(yǎng)擴增MSCs，至P3、P4、P5代分別計數(shù)獲得的MSCs數(shù)，將CMS組與對照組進行比較。
1.2.6 MSC傳代能力比較：分離5×106個骨髓單個核細胞為起始在體外培養(yǎng)擴增MSCs，進行傳代，記傳代次數(shù)，將CMS組與對照組進行比較。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法
采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件包進行數(shù)據(jù)分析計算。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用成組t檢驗，計數(shù)資料以率表示，兩組比較采用Fisher確切概率法檢驗;生長曲線結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析。顯著性檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。
2 結(jié)果
2.1 骨髓MSC的生長形態(tài)觀察
倒置顯微鏡下觀察，可見接種后24～48 h少部分單個核細胞貼壁，貼壁細胞呈圓形，有小的胞質(zhì)突起。隨著培養(yǎng)時間延長，貼壁細胞開始分裂增殖，細胞呈現(xiàn)出成纖維細胞樣梭形外觀，胞質(zhì)豐富，核大居中，核仁明顯，1周后，細胞融合成單層，形態(tài)均一，梭形突起變長，呈長梭形。貼壁的MSC增殖迅速，培養(yǎng)到10～14 d時，呈現(xiàn)90%以上的細胞融合，排列有明顯方向性，細胞呈平行狀、旋渦狀、網(wǎng)狀或輻射狀生長。胰酶消化傳代及凍存復(fù)蘇后的細胞于24 h后完全貼壁，形態(tài)與原代相似。瑞士姬姆薩染色后，于光鏡下可見成纖維樣細胞形態(tài)，胞漿呈淡藍色，可含空泡，可見數(shù)個深藍色的核仁，染色質(zhì)疏松，細胞呈平行排列生長或漩渦狀生長(見圖1)。CMS患者與對照組骨髓來源的MSC形態(tài)上差別不明顯，兩組MSC貼壁時間、集落大小無明顯差異，均在36～48 h時間內(nèi)貼壁。
圖1 慢性高原病骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)(40×)
2.2 骨髓MSC表面標(biāo)志分析醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站gydjdsj.org.cn
流式細胞儀檢測結(jié)果表明，CMS組與對照組骨髓MSC均不表達典型的造血細胞抗原分子，如CD34、CD45、HLADR、CD4、CD8、CD80等，而CD29、CD105、CD13表達為陽性，其表達量在兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。
2.3 CMS和對照組MSCs第三代(P3)生長曲線分析
CMS組骨髓MSCs在第4～5 d生長活躍，7 d后生長達平臺期，對照組培養(yǎng)6 d后生長達平臺期，結(jié)果見表1，圖2。
2.4 CMS和對照組MSCs體外擴增數(shù)量比較
